鈍頂螺旋藻干粉葉綠素a 提取方法探討

付麗麗，金晶，吉美萍，那日，郭九峰

(內蒙古大學 自治區(qū)離子束生物工程重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010021)

螺旋藻(Spirulina platensis)屬于原核藻類，表現(xiàn)為絲狀體，含有藻膽蛋白、葉綠素a、胡蘿卜素以及多糖等多種有效成分［1-3］。因其中豐富而均衡的營養(yǎng)，被譽為“人類明天最理想的食品”［4］。在螺旋藻的有機干重中，葉綠素a 占有一定的比例，在1% ～2%，因此葉綠素a 則可以作為衡量螺旋藻生物量的重要指標［5］。

提取螺旋藻葉綠素a 通常采用有機溶劑提取法、超臨界萃取和超聲提取法等。有機溶劑提取法提取率低，超臨界萃取法成本高等，超聲提取法具有提取率較高、成本低、耗時短等優(yōu)點。

本文以固液比、超聲功率、超聲時間為因素，對超聲法提取鈍頂螺旋藻葉綠素a 進行探討，確立了優(yōu)化條件。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

鈍頂螺旋藻，本實驗室培養(yǎng);乙醇、丙酮均為分析純。

ISO 9001 電子天平;KQ-100DE 數(shù)控超聲波清洗器;HITACHI U-2900 IV/VIS 紫外分光光度計。

1.2 實驗方法

稱取鈍頂螺旋藻干粉0.020 g 于30 mL 離心管中，加入提取劑10 mL，于棕色瓶中室溫浸提12 h，過濾，得上清液。

吸取一定量的葉綠素a 提取液，用紫外分光光度計測量A663、A645、A750的值。通過以下公式分別計算出葉綠素a 的濃度及其提取率。

葉綠素a 濃度(mg/L)C =12.7(A663－A750)－2.69(A645－A750)

葉綠素a 提取率(%)Y=(CV/m)×100%

式中 A663、A645、A750——葉綠素a 提取液在663，645，750 nm 處的吸光值;

C——葉綠素a 濃度，mg/L;

V——提取液體積，L;

m——螺旋藻干粉質量，mg。

2 結果與討論

2.1 提取劑的選擇

A(90% 乙醇)、B(90% 丙酮)、C(90% 乙醇-90%丙酮)(1∶1)、D(90%乙醇-90%丙酮)(1∶2)、E(90%乙醇-90%丙酮)(2∶1)對鈍頂螺旋藻干粉葉綠素a 提取率的影響見圖1。

圖1 提取劑對葉綠素a 提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction yield of chlorophyll a

由圖1 可知，90%乙醇-90%丙酮(1∶1)的葉綠素a 的提取率最高，其值為1.358%;不同試劑浸提鈍頂螺旋藻葉綠素a 的提取率依次為90%乙醇-90%丙酮(1∶1)＞90%乙醇-90%丙酮(1∶2)＞90%乙醇-90%丙酮(2∶1)＞90%乙醇＞90%丙酮。表明，兩種試劑混合的浸提效果好于單一試劑，且90%乙醇-90%丙酮(1∶1)的浸提效果最好，選為超聲法提取鈍頂螺旋藻葉綠素a 的提取劑。

2.2 單因素實驗

2.2.1 固液比對提取率的影響 稱取0.020 g 的

鈍頂螺旋藻干粉于離心管中，加入90%乙醇-90%丙酮(1∶1)，超聲功率60%，超聲時間20 min，固液比對葉綠素a 提取率的影響見圖2。

圖2 固液比對葉綠素a 提取率的影響Fig.2 Effect of extraction solid of liquid to ratio on extraction yield of chlorophyll a

由圖2 可知，隨著固液比的增大，葉綠素a 提取率先增大后減小。當固液比為1∶500(g/mL)時，葉綠素a 提取率最高，達到1.448%。因此，最佳固液比為1∶500(g/mL)。

2.2.2 超聲功率對提取率的影響 稱取0.020 g的鈍頂螺旋藻干粉于離心管中，加入10 mL 90%乙醇-90%丙酮(1∶1)，超聲時間20 min。超聲功率對葉綠素a 提取率的影響見圖3。

圖3 超聲功率對葉綠素a 提取率的影響Fig.3 Effect of extraction ultrasonic power on extraction yield of chlorophyll a

由圖3 可知，隨著超聲功率的增大，葉綠素a 提取率先增大后減小，當超聲功率為80%時，葉綠素a提取率最高為1.479%。

2.2.3 超聲時間對提取率的影響 稱取0.020 g的鈍頂螺旋藻干粉于離心管中，加入10 mL 90%乙醇-90%丙酮(1∶1)，超聲功率60%，超聲時間對葉綠素a 提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對葉綠素a 提取率的影響Fig.4 Effect of extraction ultrasonic time on extraction yield of chlorophyll a

由圖4 可知，隨著超聲時間的增加，葉綠素a 提取率先增加后減小，當時間為20 min 時效果最佳，葉綠素a 提取率達到1.419%。

2.3 正交實驗結果

以單因素實驗為基礎，進行正交實驗［6-7］，考察固液比、超聲功率、超聲時間對鈍頂螺旋藻干粉葉綠素a 提取率的影響。因素與水平見表1，結果見表2。

由表2 可知，各因素對提取率的影響依次為超聲功率＞固液比 ＞超聲時間，最優(yōu)組合為B2A2C3，即超聲功率80%，固液比1∶500(g/mL)，超聲時間20 min 時，葉綠素a 提取率最高，達到1.545%。

表1 因素水平表Table 1 Factor and level table

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3 可知，超聲功率對提取率的影響極顯著(P ＜0. 01)，固液比對提取率的影響顯著(P ＜0.05)，超聲時間無顯著性影響。

有報道［8］采用響應面法優(yōu)化螺旋藻中葉綠素的超聲提取工藝中，葉綠素提取率為1.280%。可看出，本實驗采用的優(yōu)化條件得到的結果比此報道中的葉綠素提取率高出20. 7%，達到了較好的效果，該方法不但提取率高，且成本低、耗時短，可作為提取鈍頂螺旋藻葉綠素a 的一種有效方法。

3 結論

超聲法提取鈍頂螺旋藻干粉葉綠素a 的最優(yōu)條件為:固液比1∶500(g/mL)，超聲功率80%，超聲時間20 min。該條件下，鈍頂螺旋藻葉綠素a 的提取率達1.545%。其中超聲功率對a 提取率的影響極顯著，固液比對提取率的影響顯著。

［1］ Wang L，Pan B，Sheng H，et al.Antioxidant activity of Spirulina platensis extracts by supercritical carbon dioxide extraction［J］.Food Chemistry，2007，105(1):36-41.

［2］ Patil G，Chethana S，Madhusudhan M C，et al.Fractionation and purification of the phycobiliproteins from Spirulina platensis［J］.Bioresource Technology，2008，99(15):7393-7396.

［3］ Muhling M，Belay A，Whitton B A.Variation in fatty acid composition of Arthrospira (Spirulina)strains［J］. Journal of Applied Phycology，2005，17(2):137-146.

［4］ 周志剛，尹長松.富硒極大螺旋藻整細胞、藻膽體及藻藍蛋白的光譜特性［J］.上海水產大學學報，2002(3):208-214.

［5］ 戴榮繼，黃春，佟斌，等. 藻類葉綠素及其降解產物的測定方法［J］. 中央民族大學學報:自然科學版，2004(1):75-80.

［6］ 周曉光，李為民，陳剛，等. 一種近正交實驗設計方法［J］. 空軍工程大學學報:自然科學版，2010(3):84-88.

［7］ 彭海濱.正交實驗設計與數(shù)據(jù)分析方法［J］.計量與測試技術，2009(12):39-40.

［8］ 童洋，肖國民，潘曉梅.響應面法優(yōu)化螺旋藻中葉綠素的超聲提取工藝［J］.化工學報，2009(11):2813-2819.