叉頭狀轉錄因子O1基因過表達慢病毒載體構建及其大鼠系膜細胞株的建立*

岳欣閣，劉飛，秦貴軍，王慶祝，張月

（鄭州大學第一附屬醫院1.老年內分泌科；2.內分泌科，河南 鄭州450000）

叉頭狀轉錄因子O1（forkhead box transcription factor O1，FoxO1）是FoxO亞家族中主要成員之一。國內外研究表明，FoxO1在機體能量代謝、細胞增殖/凋亡、DNA損傷/修復、抗氧化應激及腫瘤發生等過程中發揮重要作用[1-3]，但關于FoxO1的功能及其作用機制仍需進一步探討。以往研究中調節FoxO1表達的脂質體介導法及腺病毒載體等轉基因技術分別存在不足之處，如轉染效率低，特異性差，免疫損傷強、非持續性干擾等，尚不能完全滿足實驗需求，尤其不能應用于制備轉基因動物。所以，如何高效、穩定、特異性的調控細胞內FoxO1的表達成為進一步研究的基礎。慢病毒載體（lentiviral vector，LV）是一種感染范圍廣、感染效率高、免疫損傷小、包裝能力強，并能通過基因整合穩定持續的調節目的基因的轉基因技術[4]。本實驗利用基因重組技術，成功構建了包含組成性激活突變型（constitutively active，CA）FoxO1基因的過表達慢病毒載體，并感染大鼠系膜細胞株HBZY-1，建立了穩定過表達目的基因細胞株，為進一步研究FoxO1基因生物學功能提供了理想的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

人胚腎細胞系（293T）、大鼠腎小球系膜細胞株（HBZY-1）購自中國科學院細胞庫。重組FoxO1基因載體質粒和3個包裝質粒（pGag/Pol、pRev和pVSV-G）（上海吉瑪制藥技術有限公司）；高純度質粒中量抽提試劑盒（凱杰生物技術有限公司）；引物設計與合成及堿基測序（上海生工生物工程股份有限公司）；超純RNA提取試劑盒、DMEM培養液（北京索來寶科技有限公司）；鏈霉素（上海信裕生物有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；HiFi-MMLV cDNA第1鏈合成試劑盒、Ultra SYBR Mixture、哺乳動物蛋白抽提試劑盒、高靈敏度化學發光檢測試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；FoxO1兔單克隆抗體（美國Abcam公司）；β-actin兔多克隆抗體（北京中杉金橋生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與分組 293T、HBZY-1細胞均常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃、5%二氧化碳培養箱內培養。0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～3 d傳代一次，取對數生長期細胞進行實驗。實驗分為3組：空白對照組（NC組）、空慢病毒載體對照組（LV-empty-FoxO1組）和過表達慢病毒載體組（LV-CA-FoxO1組）。

1.2.2 構建組成性激活突變型FoxO1過表達慢病毒載體 根據Gene數據庫中大鼠FoxO1基因（NM 001191846.2）信息可知，其編碼序列為106～2055（共1 950 bp），翻譯成含649個氨基酸的FoxO1蛋白；再根據JEAN BUTEAU[5]的研究，由上海吉瑪公司設計并合成3個高度保守的磷酸化位點突變的大鼠FoxO1編碼序列，由丙氨酸替代3個主要的磷酸化位點（Thr24→Ala、Ser253→Ala和Ser316→Ala），并在其5’端和3’端分別加入NsiI和BamHI酶切位點。將其連接入經雙酶切的攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和鏈霉素抗性編碼序列質粒載體pGLV4-GFP，再將重組質粒載體pGLV4-GFP/CA-FoxO1轉入制備好的感受態大腸桿菌，挑選陽性的重組克隆并進行測序鑒定。然后，根據第4代慢病毒載體四質粒合成法，將重組質粒載體和3個包裝質粒（pGag/Pol、pRev和pVSV-G）混合后共轉染293T細胞，培養72 h后，收集細胞上清液，過濾、離心和濃縮后，得到高滴度的慢病毒濃縮液，將重組慢病毒載體命名為LV-CA-FoxO1。此外，構建攜帶GFP編碼序列而不含FoxO1編碼序列的空慢病毒載體（LV-empty-FoxO1）作為陰性對照。

1.2.3 檢測重組慢病毒滴度檢測 將293T細胞按2×103個/孔接種于96孔培養板中。培養24 h后，再將慢病毒原液10μl，用完全培養液十倍稀釋成6個梯度，稀釋因子（dilution factor，DF）分別為1、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5。吸棄舊培養液，每孔加入100μl不同梯度病毒稀釋液，每個梯度設4個復孔，并設立空白對照組。培養24 h后，更換新鮮培養液。繼續培養48 h后，通過倒置熒光顯微鏡觀察，結合稀釋倍數計算病毒滴度。

1.2.4 慢病毒載體感染RMCs的效率 實驗分為3組：空白對照組（NC組）、空慢病毒載體陰性對照組（LV-empty-FoxO1組） 和過表達慢病毒載體組（LV-CA-FoxO1組）。將RMCs按2×104個/孔接種于24孔培養板中。培養24 h后，吸棄舊培養液，加入完全培養液480μl/well，再分別取20μl的完全培養液、LV-empty-FoxO1病毒原液與LV-CA-FoxO1病毒原液加到相應組中。感染72 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，再經FACS檢測各組GFP陽性表達率，所測結果即為慢病毒載體感染RMCs的效率。

1.2.5 轉錄水平干涉效果檢測 將RMCs按1×105個/孔接種于6孔培養板中，培養24 h后分為3組（分組同1.2.4），各組分別加入含100μl的培養液、100μL的LV-empty-FoxO1病毒原液和100μl的LV-CA-FoxO1病毒原液的2m l完全培養液。培養72 h后，提取總RNA并測定RNA純度和濃度，逆轉錄成cDNA后進行qRT-RCP擴增。引物序列分別為：FoxO1上游：5'-AATTTGCTAAGAGCCGAGGA-3'，下 游：5'-AAGTCATCATTGCTGTGGGA-3'，擴 增片段長度為136 bp；以GAPDH為內參，上游：5'-GC CACTCAGAAGACTCTGGA-3'，下游：5'-GTTCAGCT CTGGGATGACCT-3'，擴增片段長度為129 bp。兩步法qRT-PCR反應程序為：預變性95℃，10min；變性95℃，15 s；退火/延伸60℃，1min（變性+退火/延伸，40個循環）；溶解曲線分析：95℃，15 s；60℃，1min；95℃，15 s；60℃，15 s。采用相對定量法，以Folds=2-△△Ct[5]表示待測組與對照組目的基因表達量的倍比關系，每組設6個復孔，重復3次實驗，并計算平均值。

1.2.6 翻譯水平干涉效果檢測 上述同樣條件鋪板并處理細胞。培養72 h后，提取細胞總蛋白，并用BCA法測蛋白濃度。取等量蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳、半干轉膜、封閉和剪膜，將含有目的蛋白Fox-O1（80 kD）與內參蛋白β-actin（43 kD）的PVDF膜分別置于1∶1 000稀釋的抗FoxO1抗體及1∶1 000稀釋的抗β-actin抗體，室溫孵育1 h。漂洗后，加1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的IgG二抗，室溫孵育1 h。再次漂洗后，加入電化學發光顯影劑，暗室內曝光顯影。用凝膠圖像分析系統對條帶密度掃描并分析，以β-actin為內參，應用所測目的條帶與相應β-actin條帶信號強度的比值表示目的蛋白的相對含量。重復3次實驗，并計算平均值。

1.3 統計學方法

應用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，非正態分布資料經對數轉換正態化后，應用配對t檢驗進行組間差異檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組慢病毒載體的測序鑒定

圖1 重組慢病毒質粒載體部分堿基測序圖

圖1分別為起、止部分的測序片段。測序結果表明，除3個高度保守的磷酸化位點由丙氨酸替代外（Thr24→Ala、Ser253→Ala和Ser316→Ala），其他堿基序列與FoxO1基因完整編碼序列相符，CA-FoxO1編碼序列共1 950 bp。此外，該重組基因正確插入了兩端含NsiI和BamHI酶切位點的質粒載體pGLV4-GFP中，成功構建了組成性激活突變型FoxO1過表達慢病毒載體質粒。

2.2 測定重組慢病毒載體的病毒滴度

不同梯度的病毒稀釋液感染293T細胞72 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察各個梯度的GFP表達情況。見圖2。計數最后一個含有熒光細胞的孔中的熒光細胞個數約為10個，將得到的數值除以相應的稀釋倍數10-5/10μl，即可計算出該病毒原液的滴度值約為1×108TU/ml。

圖2 不同梯度慢病毒稀釋液感染293T細胞72 h后綠色熒光蛋白表達情況（×40）

2.3 檢測重組慢病毒載體感染RMCs感染效率

RMCs被感染72 h后，LV-empty-FoxO1組與LV-CA-FoxO1組的RMCs均高效表達GFP。見圖3。流式細胞儀檢測顯示，NC組的RMCs無GFP表達，而LV-empty-FoxO1組與LV-CA-FoxO1組RMCs的GFP陽性表達率高達84.5%和81.4%，即慢病毒載體對RMCs的感染效率，且兩組GFP表達率差異無統計學意義（t=0.69，P>0.05）。見圖4。由此可知，慢病毒載體已經成功、高效地感染RMCs，重組CA-FoxO1編碼序列也已整合到宿主基因組中。因重組質粒中攜帶有鏈霉素抗性基因，所以用鏈霉素篩選RMCs，已整合有外源基因的RMCs才能夠抗鏈霉素存活下來。

2.4 qRT-PCR檢測各組FoxO1 mRNA的表達

圖3 倒置熒光顯微鏡觀察慢病毒載體感染RMCs 72 h后的綠色熒光蛋白表達情況（×100）

按不同要求處理各組RMCs 72 h后，qRT-PCR檢測的結果顯示：NC組與LV-empty-FoxO1組FoxO1 mRNA表達差異無統計學意義（P>0.05）；與NC組比，LV-CA-FoxO1組FoxO1 mRNA相當于NC組的27.92倍（t=439.1，P<0.05）。見附表。

2.5 Western bolt檢測各組FoxO1蛋白的表達

圖4 流式細胞儀分析慢病毒載體感染RMCs的綠色熒光蛋白陽性表達率

通過Gel-Pro analyzer軟件對條帶密度掃描并分析可知，RMCs被處理72 h后，NC組與LV-empty-FoxO1組FoxO1蛋白表達差異無統計學意義（t=0.92，P>0.05），與NC組相比，LV-CA-FoxO1組FoxO1蛋白表達量相當于NC組的5.41倍（t=45.91，P<0.05）。見圖5。由此可知，該重組慢病毒載體能夠高效、穩定的上調組成性激活突變型FoxO1蛋白的表達。

附表 實時熒光定量PCR檢測各組FoxO1 m RNA相對表達量情況 （n=6，±s）

附表 實時熒光定量PCR檢測各組FoxO1 m RNA相對表達量情況 （n=6，±s）

注：1）與NC組相比，P<0.05；2）與LV-empty-FoxO1組相比，P<0.05

組別 2-ΔΔCt（FoxO1）NC組 -LV-empty-FoxO1組 0.98±0.03 LV-CA-FoxO1組 27.92±1.321）2）Ct（GAPDH） Ct（FoxO1）16.81±0.24 23.44±0.34 16.29±0.14 23.10±0.40 19.21±0.381）2）18.44±0.371）2）

圖5 蛋白免疫印跡法檢測各組FoxO1蛋白相對表達水平

3 討論

叉頭狀轉錄因子目前被分為17個亞家族，Fox-A～Q。FoxO轉錄因子是其中的一個重要亞家族，FoxO1又是FoxO亞家族中被最早發現的成員之一。FoxO1轉錄因子是INS/IGF-1通路中重要信號分子，對下游靶基因的表達有一定調控作用。FoxO1有多個高度保守的蘇氨酸和絲氨酸磷酸化位點。無刺激因子時，FoxO1處于非磷酸化狀態并位于細胞核內；在生長因子或血清刺激下，FoxO1被上游活化的蛋白激酶B（PKB）磷酸化，相應位點的磷酸化可抑制FoxO1與DNA的結合，轉移至細胞質內從而失去調控下游靶基因的活性[6-7]。因此，根據JEAN BUTEAU的研究[8]，通過人工合成將高度保守的磷酸化位點絲氨酸與絲氨酸替換成丙氨酸（Thr24→Ala、Ser253→Ala和Ser316→Ala），使FoxO1蛋白不能被磷酸化，從而持續保持活性調控下游靶基因。

本研究發現，經堿基測序確定重組FoxO1基因合成正確且插入質粒載體位置正確；根據倒置熒光顯微鏡觀察，計算出該慢病毒滴度為1×108TU/ml；LV-CA-FoxO1慢病毒載體以優化條件感染RMCs 72 h后，FACS檢測RMCs的GFP表達率為81.4%，表明慢病毒載體已成功將重組外源基因整合到RMCs基因組中；實時熒光定量PCR結果顯示，LV-CA-FoxO1組FoxO1 mRNA表達量相當于對照組的27.92倍；免疫蛋白印跡法檢測LV-CA-FoxO1組FoxO1蛋白表達量相當于對照組的5.41倍。上述結果證實，本研究成功構建了大鼠組成性激活突變型FoxO1基因的過表達慢病毒載體，并建立了高效、穩定的過表達活性FoxO1的系膜細胞株。

近年來廣泛應用于細胞學研究的脂質體介導法雖具有簡單、安全，低免疫原性，可大量生產等優點，但不易獲得理想的轉染效率[9]。腺病毒載體法雖具有可感染不分裂細胞、細胞滴度高、病毒穩定易保存等優點，但其非整合作用使之不能持續表達所需產物，高免疫原性造成對細胞損傷[10]。而慢病毒載體具有感染范圍廣、感染效率高、免疫反應小、包裝能力強，并能通過基因整合穩定持續的調節目的基因等特點，特別是在制備轉基因動物時特點尤為突出[4]。

本研究采用第四代慢病毒載體組分已經過如下改造：①刪除了全部HIV-1的編碼基因；②對5’和3’LTR分別進行了刪除改造，使其不再具有啟動/增強活性，成為自滅活載體；③病毒包裝必需的3個蛋白Gag/Pol、Rev和VSV-G 分別獨立放置在pGag/Pol、pRev和pVSV-G 3個質粒上，且相互之間沒有任何同源序列，大大降低了復制型慢病毒的產生幾率。使其在安全性方面已得到大幅提高。但仍具有潛在的產生復制型慢病毒和致癌的風險，操作者在實驗中仍需要保持高度警惕。

綜上所述，本研究采用分子生物學技術和基因工程技術，構建組成性激活突變型FoxO1基因過表達慢病毒載體及篩選出穩定、高效過表達活性Fox-O1蛋白的系膜細胞株為進一步的研究FoxO1蛋白的功能和作用機制奠定了研究基礎。本課題組正以此為方法開展細胞學水平及動物體內實驗，從而進一步探索FoxO1的功能及其作用機制。

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