液質聯(lián)用法篩選黃芩中清除自由基的活性物質

劉淵宏，宋 龍

(1.甘肅奇正藏藥有限公司，蘭州 730000;2.上海中醫(yī)藥大學中藥學院，上海 201203)

液質聯(lián)用法篩選黃芩中清除自由基的活性物質

劉淵宏1，宋 龍2△

(1.甘肅奇正藏藥有限公司，蘭州 730000;2.上海中醫(yī)藥大學中藥學院，上海 201203)

目的:用液質聯(lián)用方法快速篩選黃芩藥材中用于清除人體內自由基的活性物質。方法:通過對黃芩中提取制得含4種單體(野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、黃芩素)的樣品溶液，分別與各自由基制得的溶液混合，以甲醇為對照孵化培養(yǎng)，液相色譜-質譜聯(lián)用方法對黃芩提取液中各組分分離，以峰面積的變化來進行考察。結果:清除自由基實驗結果顯示，這4種成分經過與超氧自由基、羥基自由基、過氧自由基反應后含量都有不同程度的減少。結論:黃芩中4種成分對DPPH、超氧自由基、羥基自由基和過氧自由基都具有一定的清除作用。

自由基;黃芩;液質聯(lián)用

自由基是導致人體衰老、癌癥的主要誘因，為近代科學研究所重視。在人體自由基中，活性氧(ROS)占到自由基總量的95%，其中人體內重要的活性氧自由基包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、脂氧自由基被認為是抗自由基活性物質清除自由基性能的重要評價指標［1-2］。為防治自由基對人體產生的危害，抗自由基物質開發(fā)成為科學研究的重點。在生物尤其植物中存在著大量的天然抗自由基化合物，其副作用很低、種類多且易于應用，成為抗自由基物質開發(fā)的重要方向［3-5］。

天然產物中黃酮類物質對自由基有著獨特的優(yōu)勢。黃芩作為傳統(tǒng)中藥，目前已被列入世界眾多國家的藥典，如中國、韓國、日本等。其主要活性成分即為黃酮類成分，如黃芩苷、黃芩素等，且這些成分的抗氧化、抗自由基作用也受到科學研究的重視。與此同時，黃芩地上部分(莖葉)中黃酮類物質以野黃芩苷、野黃芩素為主，具有抗氧化、抗自由基的作用。但這4種成分對人體內重要自由基清除活性，卻未得到深入研究。

抗自由基物質評價主要有體外評價和體內評價，體外評價如ABTS自由基陽離子清除實驗、超氧陰離子自由基清除實驗、羥自由基清除實驗、脂氧自由基清除實驗等［6-7］;體內評價常采用小鼠或大鼠作為實驗對象，測定結果能夠真實反映抗自由基物質在生物體內的清除活性，但由于檢測指標多而復雜、實驗周期長、費用昂貴等原因，并不適合抗自由基物質的前期篩選。

為深入研究黃芩中的抗自由基活性，本文采用體外自由基評價方法，就黃芩中所含野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、黃芩素等4種成分對人體內氧陰離子自由基、羥基自由基、脂氧自由基的清除作用進行研究，為黃芩抗自由基物質的前期篩選開發(fā)研究提供重要的理論支撐。

1 儀器與材料

HH-S4電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿有限公司;YLD-6000 SHP生化培養(yǎng)箱，揚州鴻都電子有限公司;AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;Surveyor高效液相色譜質譜聯(lián)用分析儀，美國Finnigan。

黃芩莖葉購自陜西西安，經上海中醫(yī)藥大學生藥教研室鑒定為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥全草。對照品為野黃芩苷，含量98%，阿拉丁試劑(中國)有限公司;Free Radical DPPH購于美國Sigma公司(St.Louis，MO，USA);其他實驗所用試劑均為國產分析純試劑。

2 方法

2.1 提取物制備

準確稱取黃芩地上部分6.60 g，采用熱回流法，加入350 mL甲醇，60℃提取4 h。在提取液中，按提取液中野黃芩苷含量為2%，等質量添加野黃芩素;按黃芩苷含量為8%，等質量添加黃芩素，制備為P (primary)液。

野黃芩素、黃芩素為實驗室自制。取野黃芩苷(或者黃芩苷)3.0 g，依次加入120 mL70%乙醇、20 mL濃硫酸，110℃加熱6 h，攪拌速率10 r/s。反應結束后，加入6倍體積量純水，過濾并收集濾餅即為野黃芩素(或者黃芩素)。

2.2 色譜總離子HPLC

2.2.1 色譜條件 流動相的選擇與優(yōu)化中分別采用乙腈-水、乙腈-乙酸-水、乙腈-甲酸-水、甲醇-水、甲醇-乙酸-水、甲醇-甲酸-水。通過圖譜的對比分析得出，在流動相為乙腈、甲酸和水的條件下，采用全梯度洗脫模式能夠達到最優(yōu)的分離度和選擇性，優(yōu)化的梯度洗脫條件如下(乙腈:A，0.5%甲酸水:B):0 min，A:3%，B:97%;23 min，A:10%，B:90%;40 min，A:46%，B:54%;60 min，A:100%。流速控制在0.2 ml/min，考慮分離效率的同時，兼顧色譜柱的柱填料(3 mm)和兼容后期的液質聯(lián)用分析。

液相色譜分析采用 Thermo Finnigan Surveyor HPLC系統(tǒng)，經過色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗優(yōu)化后，為在分離過程獲得更好的選擇性、分離度、靈敏度和重復性，最終確定采用色譜柱為 Thermo Hypersil GOLD C18(3 mm，150×2.1 mm，i.d.，鍵合雜化填料)的反相柱，柱溫設定為40℃;數(shù)據(jù)以3D波長采集，波長范圍在190～800 nm全波長掃描，PDA/UV檢測波長為350 nm。進樣方式采用自動進樣，部分定量環(huán)進樣模式(Partial loop)，進樣量2 μL;進樣室溫度4℃。

2.2.2 總離子色譜圖 量取P液經0.45 um過濾器過濾其雜質，進樣經HPLC分析得出其全程譜圖。經色譜指認，其中A峰為野黃芩苷，B峰為野黃芩素，C峰為黃芩苷，D峰為黃芩素。

2.3 自由基制備

2.3.1 DPPH的制備 精確稱取 0.0035 gDPPH，用無水甲醇溶解定容至50 ml容量瓶中標為A液，儲存于0～4℃冰箱中備用。

2.3.2 超氧自由基的制備 精確稱取0.0100 g核黃素用70%甲醇溶解定容至10 ml容量瓶中標為B液;取0.0250 g甲硫氨酸溶解定容于25 ml容量瓶中標為C液，以上制備液儲存于0～4℃冰箱中備用。

2.3.3 過氧自由基制備 精確稱取0.3025 g卵磷脂溶于30 ml磷酸鹽緩沖液中(50 mmol/L，pH =7.4)并超聲，冰水浴保持2 h，標為E液;準確稱取0.0148 g氯化鐵，定容至50 mL，標為F液;準確稱取0.0107 g抗壞血酸，定容至50 mL，標為H液，以上制備液儲存于0～4℃冰箱中，備用。

2.3.4 羥基自由基的制備 精確稱取0.0414 g水楊酸定容至50 mL，標為I液;準確稱取0.3006 g七水硫酸亞鐵晶體，定容至100 mL，標為J液;精確稱取0.0564 g過氧化氫溶液，定容至50 mL，標為K液，以上制備液儲存于0～4℃冰箱中備用。

2.4 自由基測定

2.4.1 DPPH清除率 實驗組準確量取2.5 mLP液和2.5mLA液混勻，37℃恒溫避光孵化2 h;對照組準確量取2.5 mLP液和2.5 mL甲醇混勻，37℃恒溫避光孵化2 h。

2.4.2 超氧自由基清除率 實驗組準確量取2.0 mlP液、1.0 mLB液、1.0 mLC液混勻，在254 nm和365 nm紫外燈下避光孵化2 h;對照組準確量取2.0 mlP液和2.0 mL甲醇混勻，在254 nm和365 nm紫外燈下避光孵化2 h。

2.4.3 過氧自由基清除率 實驗組準確量取1.0 mLP液、5.0 mLE液、2.0 mLF液、1.0 mlH液混勻，37℃恒溫避光孵化4 h;對照組準確量取1.0 mLP液、5.0 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH= 7.4)、2.0 mLF液、1.0 mlH液混勻，37℃恒溫避光孵化4 h。

2.4.4 羥基自由基清除率 實驗組準確量取5.0 mLP液、2.0 mLI液、2.0 mLJ液、2.0 mLK液，依次加入混勻，37℃恒溫避光孵化2 h。對照組準確量取5.0 mLP液、2.0 mLI液、2.0 mLJ液、2.0 mL去離子水依次加入混勻，37℃恒溫避光孵化2 h。自由基清除率計算公式:對于一個自由基實驗體系，通過實驗組和對照組對應譜峰面積的變化，就可以利用計算公式來評價相應組分的清除自由基活性，其計算公式如下:100%。其中PAcontrol是對照組的峰面積，PAexp是實驗組的峰面積。

2.5 色譜圖中組分物質的鑒定

不同自由基評價色譜圖中4種成分(野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、黃芩素)的鑒定，是對比4種物質各自的保留時間、UV光譜數(shù)據(jù)、MS以及MS2數(shù)據(jù)，并通過對各自物質的裂解規(guī)律討論進行驗證，并參考相關文獻［4-22］。

3 結果與討論

3.1 超氧自由基的評價

圖1顯示，峰1表示野黃芩苷，峰2表示野黃芩素，峰3表示黃芩素，自由基色譜數(shù)據(jù)。

3.2 羥基自由基評價

圖2表2顯示，4種成分(野黃芩苷、黃芩苷、野黃芩素、黃芩素)對超氧自由基、羥基自由基、過氧自由基具有一定的清除作用。比較而言，4種成分對3種自由基總體效果為:過氧自由基＞羥基自由基＞超氧自由基。這種效果排序驗證了前人對黃芩提取物藥理作用的研究，也驗證了黃芩全草提取物在擴張血管、改善血液微循環(huán)、提高供血水平方面的應用。

圖1 超氧自由基活性分子篩選前后對照圖

表1 超氧自由基活性分子篩選數(shù)據(jù)分析

表2 羥基自由基活性分子篩選數(shù)據(jù)分析

圖2 羥基自由基活性分子篩選前后對照圖

由清除超氧自由基實驗組和對照組分析數(shù)據(jù)及譜圖可知，經測定野黃芩苷對超氧自由基的清除率18.98%，黃芩苷對超氧自由基的清除率1.09%，黃芩素對超氧自由基的清除率24.38%，其他成分無表觀清除作用。由野黃芩苷、黃芩苷、黃芩素對超氧自由基的清除效果可知，其各自A環(huán)上的鄰羥基與其清除作用密切相關，而野黃芩素的失效，很可能是因為野黃芩苷受到超氧自由基的影響，A環(huán)7位脫去糖醛酸轉化為野黃芩素，因而掩飾了其真實效用。漢黃芩苷、白楊素-7-葡萄糖醛酸苷則是受到其B環(huán)上缺少羥基及其A環(huán)上缺失鄰羥基的原因，因而不具備超氧自由基的清除效果。

4 小結

黃芩中4種成分對3種自由基的作用可知，針對不同自由基，它們的作用效果并不相同。比較而言，黃芩素、野黃芩苷對超氧自由基的效果較好;黃芩苷對羥基自由基的效果較好;野黃芩素、黃芩素對過氧自由基的效果較好;比較野黃芩苷和野黃芩素對于過氧自由基清除作用，也驗證野黃芩苷有效藥理作用代謝成分為野黃芩素的研究報道，同時本研究為黃芩抗自由基物質的前期篩選開發(fā)研究提供重要的理論依據(jù)。

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Screening Bioactive Constituents of Scavenging Free Radicals in Scutellaria baicalensis Georgi by Using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

LIU Yuan-hong1，SONG Long2△
(1．Qizheng Tibetan Medicine Co．LTD．Gansu Lanzhou 730000，China;2．College of Pharmacy，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China)

Objectives:To rapidly screen bioactive constituents of scavenging body free radicals in Scutellaria baicalensis Georgi by using Liquid Chromatography-Mas Spectrometry(LC-MS).Methods:Mix scutellarin，baicalin，scutellarein，and baicalein sample solution with each free radical solution respectively and with methanol as control incubation cultivation，using LC-MS to detect the peak area change of each component.Results:After four components with the super oxygen free radical，hydroxyl free radical，oxygen free radical reacting，their content reduced in varying degree.Conclusions:Four components in Scutellaria baicalensis Georgi have certain scavenging effect against DPPH，superoxide free radicals，hydroxyl free radicals and peroxide free radicals.

Free radicals;Scutellaria baicalensis Georgi;LC-MS

R965.1

:B

:1006-3250(2015)09-1156-04

2015-03-02

劉淵宏，男，工程師，從事藥效物質基礎研究。

△通訊作者:宋 龍，男，醫(yī)學博士，從事中藥質量標準研究，Tel:021-51322203，E-mail:sl1976@sina.cn。