電針足三里對對乙酰氨基酚誘發大鼠肝損傷炎癥細胞因子的影響?

蒙光義，王冬曉，彭評志，龐家蓮，莫金權，楊斌，嚴明

(1.廣西玉林市第一人民醫院，廣西玉林537000;2.廣西玉林市婦幼保健院，廣西玉林537000; 3廣西醫科大學藥學院，南寧530021)

電針足三里對對乙酰氨基酚誘發大鼠肝損傷炎癥細胞因子的影響?

蒙光義1，王冬曉2，彭評志1，龐家蓮1，莫金權1，楊斌3△，嚴明3

(1.廣西玉林市第一人民醫院，廣西玉林537000;2.廣西玉林市婦幼保健院，廣西玉林537000; 3廣西醫科大學藥學院，南寧530021)

目的:研究電針足三里對對乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)誘發大鼠肝損傷炎癥細胞因子水平的影響，探討其對藥源性肝損傷的保護作用。方法:SD大鼠按隨機數字表法分為NC組、APAP1組和Acup1組、APAP2組和Acup2組，各組大鼠連續給藥或針刺14 d后，檢測大鼠血清和肝臟組織勻漿液白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。結果:與APAP1組和APAP2組比較，Acup1組和Acup2組大鼠血清谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)活性水平均顯著性升高。與APAP1組和APAP2組比較，Acup1組和Acup2組大鼠血清和肝臟勻漿組織液中IL-6、IL-8和TNF-α含量水平均顯著升高。結論:電針足三里上調APAP誘導大鼠肝損傷血清和肝臟組織炎癥細胞因子的反應和表達水平，可能會對APAP誘導的肝臟損傷具有一定的促進作用。

電針足三里;對乙酰氨基酚;肝損傷;白細胞介素6;白細胞介素8;腫瘤壞死因子a;大鼠

“足三里”屬于足陽明胃經之合穴。研究顯示，電針足三里對酒精、內毒素等毒物所致的肝損傷具有保護作用。而肝損傷與炎癥細胞因子密切相關，故明確電針足三里對機體炎癥細胞因子表達與反應的影響，對闡明其保護肝損傷的作用機制具有重大意義。因此，本研究通過觀察電針足三里對APAP多次給藥誘發大鼠肝損傷炎癥細胞因子水平的影響，探討其對IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥細胞因子調節作用與肝損傷的關系。

1 材料

1.1 動物分組

SD大鼠75只，雌雄各半，體質量(230±20)g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供(動物使用許可證號SYXK桂2003-0005)。按隨機數字表法分為5組，即模型1組和模型2組(分別簡稱APAP1組和APAP2組)、電針1組和電針2組(分別簡稱Acup1組和Acup2組)、正常對照組(簡稱NC組)，每組各15只。

1.2 藥品試劑

對乙酰氨基酚片(中美天津史克制藥有限公司，批號08060373);谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所生產，批號2008114和20081114);大鼠白介素-6、白介素-8和腫瘤壞死因子定量酶聯檢測試劑盒(美國R＆D公司，進口分裝，批號0812073、0812083和0812084)。

1.3 主要儀器

G6805-Ⅰ型針灸治療儀(青島鑫升實業有限公司)，電熱恒溫水浴(北京長安科學儀器廠)，低溫高速離心機(上海安亭科學儀器廠)，722S分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，CO2培養箱(美國Thermo Forma公司)，MULTISKAN MK3酶標儀(美國Thermo Forma公司)。

2 方法

2.1 電針穴位

根據動物穴位定位圖譜［1］，選取大鼠后肢雙側足三里穴于膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處直刺7 mm，針刺后連接G6805-Ⅰ型針灸治療儀持續電針刺激20 min(電針治療儀參數設定為疏密波，頻率14 Hz，強度以大鼠安靜耐受為度，約1mA，保持大鼠清醒狀態，以雙下肢輕微抖動為宜)。

2.2 給藥方案

APAP1組和APAP2組分別按體質量灌胃給予APAP 300和600mg/kg，而Acup1組和Acup2組分別按體質量灌胃給予APAP 300和600 mg/kg后，即刻固定在大鼠固定器內，電針其后肢雙側足三里穴位20 min;NC組則給予相同體積劑量的生理鹽水。各組大鼠連續給藥或電針14 d，末次給藥24 h后采集大鼠血清和肝臟等標本進行測定。

2.3 指標測定

摘除大鼠眼球采集靜脈血靜置0.5～1.0 h，3500 r/min離心15 min分離血清，4℃保存待測。處死大鼠，取部分肝臟加入冰冷的生理鹽水于冰浴中勻漿成10%肝臟組織勻漿液，離心分取上清液，放于-20℃冰箱保存待測。采用賴氏法測定各組大鼠血清ALT和AST活性水平，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定血清和肝臟組織炎癥細胞因子IL-6、IL-8和TNF-α含量。

2.4 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間均數比較采用方差分析，2組間比較采用t檢驗，以α=0.05為顯著性檢驗水準。

3 結果

3.1 電刺足三里對APAP誘導大鼠血清轉氨酶的影響

表1顯示，與NC組比較APAP2組大鼠血清AST、ALT活性水平均明顯升高(P＜0.01)，表明APAP2組成功建立了肝損傷模型。與APAP1組和APAP2組比較，Acup1組和Acup2組大鼠AST和ALT活性水平進一步增高，相應組別間比較差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，提示電刺足三里能夠促進APAP誘導大鼠血清AST和ALT活性水平的進一步升高。

表1 電針足三里對APAP誘導大鼠血清AST和ALT活性的影響(±s)

表1 電針足三里對APAP誘導大鼠血清AST和ALT活性的影響(±s)

注:與NC組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與相應模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別鼠數AST(U·L-1)ALT(U·L-1)空白對照組(NC組)15107.36±24.9422.15±6.32模型1組(APAP1組)15102.71±31.7725.69±11.92電針1組(Acup1組)14140.34±43.95△＊44.17±15.24△△＊＊模型2組(APAP2組)11281.89±63.85△△39.53±11.91△△電針2組(Acup2組)13532.19±136.18△△＊＊65.04±22.18△△＊＊

3.2 電針足三里對APAP誘發肝損傷大鼠血清炎癥細胞因子的影響

表2顯示，與NC組比較各模型組和電針組大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量水平均明顯升高(P＜0.01)，提示APAP能夠誘導血清炎癥細胞因子水平的增高，誘發機體炎癥反應的發生。與APAP1和APAP2組比較，Acup1組和Acup2組大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量水平進一步顯著性增高，組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，提示電針足三里能夠上調APAP誘導大鼠血清炎癥細胞因子的表達水平。

表2 電針足三里對APAP誘發肝損傷大鼠血清炎癥細胞因子的影響(±s)

表2 電針足三里對APAP誘發肝損傷大鼠血清炎癥細胞因子的影響(±s)

注:與NC組比較:△P＜0.01;與相應模型組比較:*P＜0.01

組別鼠數IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)TNF-α(pg/ml)空白對照組(NC組)1533.24±8.0516.02±3.354.43±1.14模型1組(APAP1組)1557.19±12.42△29.84±5.22△4.38±1.05電針1組(Acup1組)1484.33±17.60△＊44.72±8.16△＊10.06±2.11△＊模型2組(APAP2組)11172.07±31.76△59.16±11.08△16.34±2.91△電針2組(Acup2組)13256.84±36.52△＊76.48±18.35△＊21.18±6.27△＊

3.3 電針足三里對APAP誘發肝損傷大鼠肝臟炎癥細胞因子的影響

表3顯示，與NC組比較，各模型組和電針組大鼠肝臟IL-6、IL-8和TNF-α含量水平均明顯升高(P＜0.01)。與APAP1和APAP2組比較，Acup1組和Acup2組大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量水平進一步顯著性增高(P＜0.01)，提示APAP能夠誘導肝臟組織炎癥細胞因子水平的增高，誘發肝臟炎癥反應的發生;而電針足三里則加劇誘導APAP所致肝損傷炎癥細胞因子的進一步表達和反應，上調其表達水平。

表3 電針足三里對APAP誘發肝損傷大鼠肝臟炎癥細胞因子的影響(±s)

表3 電針足三里對APAP誘發肝損傷大鼠肝臟炎癥細胞因子的影響(±s)

注:與NC組比較:△P＜0.01;與相應模型組比較:*P＜0.01

組別例數IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)TNF-α(pg/ml)空白對照組(NC組)15215.34±53.18134.97±37.4037.22±8.94模型1組(APAP1組)15347.28±77.94△261.04±51.42△62.83±12.06△電針1組(Acup1組)14984.33±183.60△＊544.72±98.16△＊110.06±20.75△＊模型2組(APAP2組)111329.40±230.67△873.56±153.08△261.60±47.94△電針2組(Acup2組)131682.15±344.05△＊1125.62±197.42△＊336.75±68.23△＊

4 討論

APAP長期大劑量使用時，代謝產生的N-乙酰對苯醌亞胺能夠誘發肝細胞變形壞死導致肝損傷，而血清轉氨酶則是肝細胞損傷的敏感標志物。研究結果顯示，APAP2組大鼠連續給予600mg/kg劑量APAP 14 d后誘發肝損傷，而電針足三里則進一步促進大鼠血清AST和ALT活性水平的升高，提示其可能促進肝臟的進一步損傷。

TNF-α主要由單核細胞和巨噬細胞產生，是機體炎癥反應起關鍵始動作用的促炎細胞因子［2-3］。IL-6和IL-8與TNF-α共同組成機體的正性致炎因子，使細胞發生趨化運動、激活中性粒細胞釋放彈性蛋白，生成活性氧化代謝物及引起組織浸潤反應，造成肝細胞壞死和轉氨酶升高［4-5］。因此，有效抑制機體中TNF-α等炎癥細胞因子水平，對減輕炎癥反應和器官組織損傷具有重要意義。實驗結果顯示，APAP1組和APAP2組大鼠血清和肝臟組織IL-6、IL-8和TNF-α含量水平表達水平均與血清AST和ALT活性水平的升高趨勢相一致，表明大劑量的APAP能夠誘導炎癥細胞因子的上調表達水平，誘發肝臟炎癥反應的發生。

文獻報道表明，電針足三里能夠抑制炎癥細胞因子的表達水平和減輕各種器官的炎癥反應。胡森等［6-7］研究結果表明，電針足三里顯著抑制盲腸結扎穿孔術制備膿毒癥模型大鼠肝臟炎癥細胞因子表達水平，減輕肝臟組織水腫和功能損傷?；魟t軍等［8］研究表明，電針足三里通過下調TNF-α和IL-6表達水平而抑制炎性反應，對脊髓缺血再灌注損傷家兔有一定的神經保護作用。李文迅［9］研究表明，電針足三里可以對機體TNF-α等炎癥細胞因子的產生良性誘導，改變相關炎性細胞因子的合成與釋放，提高慢性佐劑性關節炎大鼠的抗炎修復功能。

本研究結果顯示，電針足三里促進APAP誘導炎癥細胞因子水平的表達上調，且與其促進血清AST和ALT活性水平的升高趨勢相同，表明電針足三里能夠促進APAP誘導大鼠肝臟炎癥的進一步反映，可能會促進APAP誘導肝臟的進一步損傷。顯然，本研究結果與上述相關文獻報道不一致，可能與選用造模藥物或針刺方法不同等因素有關。筆者的前期研究結果表明，電針足三里能夠促進APAP在大鼠體內的吸收而增大其生物利用度，減慢藥物清除率，延長其在體內的平均滯留時間［10］。因此，筆者推測電針足三里促進APAP所致炎癥細胞因子水平的上調表達，從而促進肝臟的進一步損傷，可能與電針足三里促進APAP生物利用度增大、而清除率減慢、導致APAP積蓄中毒誘發肝損傷有關，電針足三里可能間接地促進APAP誘導肝臟的進一步損傷。

中醫理論認為，電針足三里能夠對機體進行雙向調節，電針足三里促進APAP誘導促炎細胞因子上調表達的同時，是否相應上調有關抗炎細胞因子(如IL-4、IL-10和IL-13等)的表達和反應來維持促炎和抗炎的平衡，以保護APAP誘發的肝損傷尚未明確，電針足三里對肝損傷的影響作用及其相關作用機制都有待進一步的深入研究。

［1］李忠仁.實驗針灸學［M］.北京:中國中醫藥出版社，2003: 327-328.

［2］張立儉，石現，白慧穎，等.電針足三里對膿毒癥大鼠促炎癥因子所致心肌損傷的保護作用［J］.軍醫進修學院學報，2010，31(4):377-381.

［3］袁少英，覃湛，劉東生，等.針刺治療慢性骨盆疼痛綜合征(CPPS)及其對前列腺液中細胞因子的影響［J］.中國針灸，2011，31(1):14.

［4］邢杰，陳英利，陶淑華，等.免疫性肝損傷相關細胞因子研究進展［J］.中國病原生物學雜志，2009，4(1):71-75.

［5］孫華，趙慧，張捷，等.針刺百會、足三里對抑郁癥患者血清炎性細胞因子水平的影響［J］.中國針灸，2010，30(3):195-199.

［6］胡森，張立儉，白慧穎，等.電針足三里對膿毒癥大鼠組織腫瘤壞死因子和多臟器功能損害的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26(2):353-356.

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［10］嚴明，王柳萍，蒙光義，等.電針“足三里”對對乙酰氨基酚藥代動力學的影響［J］.中國針灸，2010，30(7):577-582.

Effect of Acupuncture at Zusanli Acupoint on Inflammatory Cytokines of Hepatic Injury With Given Multiple Doses of Paracetamol in Rats

MENG Guang-yi1，WANG Dong-xiao2，PENG Ping-zhi1，PANG Jia-lian1，MO Jin-quan1，
YANG Bin3△，YAN Ming3(1．The First People's Hospital of Yulin City，Guangxi，Yulin 537000，China;2．The Maternal and Child Health-Care Hospital of Yulin City，Guangxi，Yulin 537000，China;3．Pharmacy College，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

Objective:To investigate the effects of acupuncture at Zusanli acupoint on inflammatory cytokines changes in rats with given multiple doses of paracetamol，and the protective effect of acupuncture on hepatic injury.Methods:SD rats were divided into five groups，the NC group，the APAP1group and the Acup1group，the APAP2group and the Acup2group.Each group was given paracetamol or saline once a day for 14 continuous days，and the serum levels of alanine transaminase(ALT)and aspartate transaminase(AST)of the rats were measured，and the levels of Interleukin 6(IL-6)、Interleukin 8(IL-8)、tumor necrosis factor-α(TNF-α)in serum and liver tissue homogenate were determined by euzymelinked immunosorbent assay(ELISA)respectively.Results:Compared with groups of APAP1andAPAP2，the levels of serum AST and ALT were significantly increased in groups of Acup1and Acup2.And compared with groups of APAP1andAPAP2，the levels of IL-6，IL-8 and TNF-α in the serum and liver were significantly increased in groups of Acup1and Acup2.Conclusion:The results suggest that electroacupuncturing Zusanli acupoints can increase levels of inflamatory IL-6，IL-8 and TNF-α in the serum and liver，and may promote liver damage induced by paracetamol.

Electroacupuncture Zusanli;paracetamol;hepatic injury;Interleukin 6;Interleukin 8;tumor necrosis factor-α;rat

R245.9+7

:B

:1006-3250(2015)05-0575-03

2015-02-08

廣西自然科學基金資助項目(桂科自0991135):針刺對對乙酰氨基酚所致肝損傷的保護作用機制研究

蒙光義(1983-)，男，廣西靈山人，主管藥師，醫學碩士，從事臨床藥理學和藥物毒理學研究。

△通訊作者:楊斌(1964-)，男，廣西靈山人，教授，醫學博士，碩士研究生導師，從事藥物毒理學和中藥藥理學研究，Tel:0771-5358272，E-mail:yangbin2003202@sina.com。