電針內關穴對心肌缺血大鼠ATP敏感性鉀離子通道蛋白的影響?

李迪，王穎，戴儉宇，劉昱甫，荊秦，王熙，王列

(遼寧中醫藥大學針灸推拿學院，沈陽110847)

電針內關穴對心肌缺血大鼠ATP敏感性鉀離子通道蛋白的影響?

李迪，王穎△，戴儉宇，劉昱甫，荊秦，王熙，王列

(遼寧中醫藥大學針灸推拿學院，沈陽110847)

目的:研究電針循經穴位與其他穴位對心肌缺血大鼠心肌細胞ATP敏感性鉀離子通道相關蛋白表達的影響。方法:通過注射鹽酸異丙腎上腺素制作大鼠心肌缺血模型，針刺內關、列缺、非經非穴進行干預，采用Western blot檢測Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B的蛋白表達水平。結果:與模型組比較，內關組和列缺組蛋白表達均顯著降低，非經非穴組蛋白表達降低不顯著;與列缺組比較，內關組蛋白表達顯著降低。結論:電針內關穴和列缺穴均可降低心肌缺血大鼠心肌細胞ATP敏感性鉀通道相關蛋白的表達，且心包經內關穴的針刺效應優于列缺穴。

心肌缺血;ATP敏感性鉀離子通道;蛋白表達;內關

ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channels，KATP通道)是日本學者Noma于1983年在豚鼠的心肌細胞中首先發現的［1］，它是由2個亞基構成的四聚體，即內向整流鉀通道(inwardly-rectifying potassion channel，Kir)和ATP結合蛋白超家族成員磺酰脲類受體(SUR)。構成KATP通道的Kir和SUR分別有Kir6.1、Kir6.2和SUR2A、SUR2B 2種亞型。在心肌細胞中，KATP通道的主要表達形式是Kir6.2和SUR2A［2］。

ATP是KATP通道最強而有效的內源性阻滯劑。在生理狀態下，心肌細胞內的ATP濃度相對較高，能夠與KATP通道上的ATP結合位點結合而達到飽和，從而使KATP通道處于關閉狀態。在心肌缺血時，心肌細胞內的ATP濃度降低，ATP/ADP比率下降，KATP通道上的ATP結合不足，致使KATP通道開放。激活的KATP通道可以促進K+外流增加，心肌細胞趨于復極化或超極化，縮短動作電位時程;同時能夠抑制Na+-Ca2+通道，降低心肌細胞Ca2+濃度，減輕Ca2+超載，使心肌收縮力降低，心肌耗氧量減少，從而產生心肌保護作用［3-4］。

本實驗通過注射異丙腎上腺素法復制心肌缺血大鼠模型，采用Western Blot檢測方法，觀察不同經脈穴位對心肌細胞KATP通道相關蛋白(Kir6.1、Kir6.2、SUR2A、SUR2B)表達的影響，探討“穴位-經脈-心臟”之間的特異性聯系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SPF級SD大鼠72只，體質量(200± 25)g，由遼寧長生生物技術有限公司提供(許可證號SCXE2010-0001)，在室溫(24±1)℃、相對濕度(50±5)%的同等條件下適應性飼養1周。

1.2 主要試劑及儀器

鹽酸異丙腎上腺素(美國SIGMA公司，I5627-5G)，Rabbit Anti-Kir6.1 antibody(美國Abcam公司，ab80972)，Rabbit Anti-Kir6.2 antibody(美國Abcam公司，ab79171)，Goar Anti-SUR2A antibody(美國Abcam公司，sc32462)，Goar Anti-SUR2B antibody (美國Abcam公司，sc5793)，Mouse Anti-GAPDH Monoclonal antibody(美國Abcam公司，20120912)。

BL-420S生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)，6805-D電針儀(汕頭市醫用設備有限公司)，“華佗牌”針刺針(0.18 mm×0.25 mm蘇州醫療用品廠有限公司)，-80℃超低溫冰箱(日本SANYO電器集團)，TGL-20M高速臺式冷凍離心機(湘儀離心機廠)，TS-1000水平脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，MINIVE蛋白電泳及轉印系統(GE公司)，IQ350冷CCD凝膠成像系統(GE公司)。

1.3 方法

采用0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射法對大鼠進行麻醉后，描述正常狀態下心電圖。按隨機數字表法抽取10只大鼠作為對照組，采用一次性多點位(四肢內側根部)注射生理鹽水(85 mg/kg);其余62只大鼠以同樣方式注射鹽酸異丙腎上腺素(85 mg/kg)復制動物模型。間隔24 h注射1次，再次描述心電圖。當心電圖出現T波由正變負或雙相并伴有ST段抬高、QRS波增寬、竇性心動過速、期前收縮或其他心律失常等現象時，則認為造模成功［5-6］(圖1、2)。將造模成功的40只大鼠按隨機數字表法分為模型組、內關組、列缺組、非經非穴組每組各10只。

內關穴、列缺穴的定位依據《實驗針灸學》［7］中大鼠針灸穴位的定位方法進行定位，非經非穴定位于大鼠腹部神闕與天樞連線的中點。采用“華佗牌”針灸針(0.18 mm×0.25 mm)順經30°角斜刺入各組大鼠相應穴位皮下2 mm。待大鼠穩定后接入電針儀，施以疏密波，頻率2～20Hz，電流強度以大鼠前肢出現與電針頻率相一致的輕微顫動為宜。留針20 min，每日1次，連續7次。對照組與模型組不進行針刺。

1.4Western blot分析

將各組大鼠斷脊處死，在冰袋上迅速分離出心臟組織，用冰生理鹽水沖洗干凈，將組織盡量剪碎后放置于玻璃勻漿器中，與裂解液按1∶1000比例混合。充分裂解后，以12000 r/min，4℃離心10 min取上清液，加入1 oading煮沸5 min以定性。采用Broadford蛋白濃度測定法測定蛋白濃度，以確定上樣量。

配置濃縮膠和分離膠，將Mark與樣本按照順序以50μg/孔上樣后電泳(電源參數:濃縮膠80 V，約15 min，分離膠120 V，以不跑出膠外為主);將蛋白樣品轉移到PVDF膜上(電源參數:80 mA，20 V，3 h);將轉移膜取下，用TBST從下向上浸濕后轉至含有封閉液(5%脫脂奶粉)的平皿中，37℃水浴震蕩1 h;對照標準Marker將膜上的目標蛋白剪下，同時將一抗用封閉液稀釋到適當濃度，一起放入雜交袋中，37℃水浴震蕩1 h后4℃過夜;用TBST在室溫下脫色搖床上液洗3次，每次5 min。同樣方法封閉液配置二抗并與膜接觸，37℃水浴震蕩孵育1 h后，TBST在室溫下脫色搖床上液洗4次，每次5 min;使用IQ350冷CCD凝膠成像系統觀察結果，分析目標條帶和內參條帶的凈光密度值以及比值。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行統計分析，以均數±標準差(±s)表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心電圖T波電壓變化

表1顯示，實驗過程中對照組大鼠心電圖無明顯變化(P＞0.05);造模后，模型組、非經非穴組、內關組和列缺組大鼠心電圖T波電壓變化有統計學意義(P＜0.05)。與造模后比較，針刺后的內關組和列缺組大鼠心電圖T波電壓變化有統計學意義(P＜0.05)，且內關組大鼠心電圖T波電壓升高幅度明顯大于列缺組，非經非穴組大鼠心電圖T波電壓變化無統計學意義(P＞0.05)。

表1 實驗過程中各組大鼠心電圖T波電壓變化(±s)

表1 實驗過程中各組大鼠心電圖T波電壓變化(±s)

注:組內與造模前比較:◆P＜0.05，◆◆P＜0.01;與造模后比較:▼P＜0.05，▼▼P＜0.01。組間針刺后與對照組比較:■P＜0.05，■■P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別鼠數(只)造模前造模后針刺后對照組100.139±0.0620.131±0.0520.152±0.038模型組100.134±0.0670.042±0.032◆◆0.044±0.032◆◆■■非經非穴組100.127±0.0280.043±0.020◆◆0.045±0.021◆◆■■內關組100.143±0.0300.042±0.010◆◆0.117±0.039◆▼▼■▲▲列缺組100.122±0.0340.041±0.024◆◆0.082±0.046◆▼■■▲

2.2 各組大鼠KATP通道相關蛋白表達變化

圖3表2顯示，在western blot檢測中，Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B蛋白表達量的變化趨勢呈現一致性。心肌缺血時，模型組的蛋白表達量明顯低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。電針7 d后與模型組比較，內關穴組、列缺穴組各指標的蛋白表達量升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，且內關組明顯高于列缺組(P＜0.05);非經非穴組各指標的蛋白表達量變化不顯著，差異無統計學意義(P＞0.05)。

圖1 造模前大鼠心電圖

圖2 造模后大鼠心電圖

圖3 各組大鼠左室心肌細胞Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B蛋白表達情況

表2 各組大鼠左室心肌細胞Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B蛋白表達情況(±s)

表2 各組大鼠左室心肌細胞Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B蛋白表達情況(±s)

注:與對照組比較:■P＜0.05，■■P＜0.01;與模型組比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別鼠數(只)Kir6.1Kir6.2SUR2ASUR2B對照組100.204±0.0200.209±0.0290.219±0.0210.241±0.029模型組100.374±0.031■■0.383±0.029■■0.468±0.034■■0.491±0.059■■非經非穴組100.360±0.002■■0.372±0.039■■0.437±0.009■■0.468±0.027■■內關組100.258±0.029■▲▲0.264±0.016■▲▲0.291±0.018■▲▲0.316±0.033■▲▲列缺組100.310±0.047■■▲0.317±0.025■■▲0.374±0.058■■▲▲0.393±0.033■■▲

3 討論

心肌缺血是指心臟的血流量減少、供氧減少、心肌細胞能量代謝不正常、不能支持心臟正常工作的一種病理狀態，其主要病理機制是冠狀動脈粥樣硬化造成的冠脈狹窄或閉塞，改善冠狀動脈的病理狀態已被廣泛關注［8-9］。

冠狀動脈起始于主動脈干的冠狀動脈竇，經左右心耳與肺動脈干之間產生分支，形成血管網散布于心臟大部分。冠狀動脈為心臟提供血液，血流總量占心輸出量的4%～5%。在中醫理論中，心包絡是心臟外面的包膜，是心臟的外圍組織，其上附著通行氣血的脈絡，起著保護心臟、代心受邪的作用。由于冠狀動脈與心包絡的形態與功能相似，學者普遍認為冠狀動脈與心包絡有密切的聯系［10］。現代研究中，大鼠內關穴區神經和心臟神經的投影進行示蹤時發現，大鼠C5-C7脊神經節及迷走神經節中存在著同源細胞，針刺內關穴可以通過這些同源細胞來調節心臟的功能活動，這揭示了“內關-脊神經節-心臟短反射”的存在［11］。另外有報道指出，來自內關穴和來自心臟的感覺神經纖維的細胞體在C6-T1脊神經節中匯聚，來自內關穴和心臟的交感節后纖維的細胞體在交感神經頸下節和T1-T3交感神經節中共存，這些交匯處的神經節構成了軀體神經與內臟神經之間機能聯系的樞紐，是針刺內關穴得氣感與心臟神經效應伴同發生的結構基礎［12］。列缺穴所在的部位受前臂外側皮神經的支配［13］，前臂外側皮神經是臂叢外側束所發出的肌皮神經的分支之一，而支配肌皮神經脊髓階段是C5-C7［14］。與內關穴相似，列缺穴也與支配心臟的脊髓階段相重合。

內關是手厥陰心包經別走手少陽三焦經的絡穴。內關穴與陰維脈相通，是八脈交會穴之一，陰維脈病可以導致心痛，如《難經·二十九難》所言“陰維為病苦心痛”。內關穴的穴位特性是內關治療心病的主要機理和依據，使之成為歷代醫家治療心痛病癥的首選穴。心包是心的護衛，直接與心相連，正如《滑壽醫學全書》記載:“心包，一名手心主，以藏象校之，在心下橫膜之上，豎膜之下。其與橫膜相黏，而黃脂裹者，心也。脂膜之外，有細筋膜如絲，與心肺相連者，心包也。”同時可以看出，肺是借助心包間接地與心相聯系。而列缺穴是手太陰肺經的絡穴，手太陰肺經內屬于肺，肺主宗氣、朝百脈，宗氣灌注心脈行氣血，對心主血脈起到輔助作用。因此，針刺手太陰肺經的列缺穴治療心臟病不如手厥陰心包經內關穴效果直接而顯著。

本實驗通過制造心肌缺血模型發現，模型組大鼠心電圖T波電壓下降，心肌細胞膜上KATP通道蛋白表達水平明顯升高。電針7 d后，內關組和列缺組大鼠心電圖T波電壓升高顯著，且左心室心肌細胞上的KATP通道蛋白的表達量均降低，而非經非穴組的T波電壓和蛋白表達變化不明顯。結果表明，電針內關穴和列缺穴均可改善大鼠心肌缺血的癥狀，且內關組的針刺效應優于列缺組。本實驗證實，針刺手厥陰心包經內關穴治療心肌缺血具有循經特異性的特點。

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Effect of Neiguan point on the Protein Expression of ATP-sensitive potassium channels of Rat with Myocardial ischemia

LI Di，WANG Ying△，DAI Jian-yu，LIU Yu-fu，JING Qin，WANG Xi，WANG Lie
(Acupuncture and Massage College，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110847，China)

Objective:To study the effect of needling at points of pericardium meridian of Hand Jueyin on the protein expression of ATP-sensitive potassium channels in rat cardiomyocytes of myocardial ischemia(MI)，compare selecting acupoints according to meridian with others.Methods:SD rats were randomly divided into control group，model group，Neiguan-point group，Lieque-point group and non-meridians-points group，and observe the change of the channel in rat cardiomyocytes of MI by the method of western blot.Results:Compared with model group，the protein expression of Neiguan-point group and Lieque-point group were decreased.There was no significance between non-meridiams-points group and model group.The protein expression of Neiguan-point group was lower than Lieque point group，but it was higher than control group.Conclusion:Electro-acupuncture(EA)at Neiguan-points and Lieque-points can decrease the protein expression of ATP-sensitive potassium channels in myocardial cells，and the effect of Neiguan-point was better than Liequepoint.

Myocardial ischemia;ATP-sensitive potassium channels;Protein expression;Neiguan-point

R245.9+7

:B

:1006-3250(2015)05-0571-04

2015-02-24

國家重點基礎研究發展計劃(2012CB518500)-經穴效應循經特異性靶器官響應的生物學基礎研究

李迪(1988-)，女，在讀碩士，從事針灸機理的臨床與研究。

△通訊作者:王穎(1964-)，男，副教授，醫學碩士，從事針灸機理的臨床與研究，E-mail:wangrying@126.com。