黃癸素對人乳腺癌MCF-7細胞遷移和侵襲的作用機制分析

鄭春艷

(湖北中醫藥大學附屬醫院乳房專科，武漢430061)

黃癸素對人乳腺癌MCF-7細胞遷移和侵襲的作用機制分析

鄭春艷

(湖北中醫藥大學附屬醫院乳房專科，武漢430061)

目的:探討黃癸素對人乳腺癌MCF-7細胞遷移和侵襲的作用機制。方法:采用Western blot法檢測黃癸素對MCF-7細胞信號通路分子STAT3及AKT表達的影響，采用細胞劃痕實驗檢測黃癸素對MCF-7細胞遷移能力的影響以及采用TranswellTM細胞侵襲實驗檢測黃癸素對MCF-7細胞侵襲能力的影響。結果:黃癸素可明顯上調STAT3及AKT的表達;黃癸素組、黃癸素聯合DMSO組、黃癸素聯合JAK/STAT3組、黃癸素聯合PI3K/AKT組平均劃痕率與對照組比較差異有統計學意義;黃癸素可促進MCF-7細胞的遷移力，JAK/STAT3信號通路抑制劑AG490及PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002可抑制黃癸素對MCF-7細胞的促遷移作用。黃癸素組、黃癸素聯合DMSO組、黃癸素聯合JAK/STAT3組、黃癸素聯合PI3K/AKT組穿膜細胞數與對照組比較，差異有統計學意義，黃癸素能夠促進MCF-7細胞的促侵襲作用。結論:黃癸素對MCF-7細胞的促遷移作用與PI3K/AKT及JAK/STAT3信號通路有關，黃癸素促進MCF-7細胞的侵襲特性與JAK/STAT3信號通路有關。

黃癸素;乳腺癌MCF-7細胞;遷移;侵襲;機制

乳腺癌是最常見的一種惡性腫瘤，嚴重威脅女性的生命健康［1-2］。黃癸素是由新魚腥草鈉與鹽酸小檗堿經離子配對形成的一種新化合物［3］。研究報道顯示，黃癸素對人癌細胞裸鼠移植瘤及小鼠移植性腫瘤具有一定的抑制作用，且與小檗堿相似體外實驗對多種腫瘤細胞具有抑制作用，還能夠抑制腫瘤轉移及誘導細胞凋亡［4-5］。本文主要分析黃癸素對人乳腺癌MCF-7細胞遷移和侵襲的作用機制，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 藥材及細胞

黃癸素(來自于湖南省中醫藥研究所賈本真提供)、人乳腺癌MCF-7細胞(購買于四川大學華西藥學院)。

1.2 主要試劑

DMEM(含高糖、丙酮酸鈉)培養基(北京科盈美科技有限公司)，胎牛血清(上海拜力生物血清網)，TranswellTM小室(北京萌壯科技有限公司)，兔抗人AKT(Cell Signaling公司)，鼠抗人STAT3單克隆抗體(Cell Signaling公司)，Matrigel膠(上海前塵生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養于37℃、5%CO2條件下應用10%胎牛血清的DMEM培養基培養MCF-7細胞。

1.3.2Western blot法檢測黃癸素對MCF-7細胞信號通路分子STAT3及AKT表達的影響取對數生長期的MCF-7細胞，采用胰酶消化(2.5 g/L)，再用PBS溶液洗滌2～3次，無血清培養液的DMEM進行重懸，調整細胞密度為5×106/ml，將其加入至6孔板中，每孔加入細胞體積為100ul。培養24 h，細胞同步化后將其上清液倒去，PBS洗滌3次，加無血清培養液的DMEM。分為對照組與實驗組(黃癸素處理組)，對照組加入PBS，實驗組加入0.1 ug/ml黃癸素處理，作用60～90 min后提取總蛋白，采用Western blot法檢測由黃癸素處理后的MCF-7細胞STAT3及AKT蛋白表達變化，以βactin作為內參照物。

1.3.3 黃癸素對MCF-7細胞遷移能力的影響

采用細胞劃痕實驗進行檢測，分為對照組、黃癸素組、黃癸素聯合DMSO組、黃癸素聯合JAK/STAT3及黃癸素聯合PI3K/AKT組。黃癸素處理前60～90 min，在6孔板內使用100 ul的移液器進行垂直劃痕，采用PBS溶液洗滌2～3次，將脫落的細胞除去，加無血清DMEM培養液。黃癸素聯合DMSO組加入DMSO，黃癸素聯合JAK/STAT3加入50 μmol/的JAK/STAT3信號通路抑制劑AG490，黃癸素聯合及PI3K/AKT組加入10 μmol/L的PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002。60～90 min后對照組加入DMSO，其余各組均給予0.1 ug/ml黃癸素處理。觀察處理好的0 h、48 h MCF-7細胞遷移變化，并計算平均劃痕愈合率(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%，重復3次。

1.3.4 黃癸素對MCF-7細胞侵襲能力的影響

采用TranswellTM細胞侵襲實驗進行檢測，分為對照組、黃癸素組、黃癸素聯合DMSO組、黃癸素聯合JAK/STAT3及黃癸素聯合PI3K/AKT組。細胞采用胰酶消化(2.5 g/L)，再用PBS溶液洗滌2～3次，無血清培養液的DMEM進行重懸，調整細胞密度為5×106/ml。預先在TranswellTM次上室加入Matrigel 50 ul，37℃下孵育0.5h，Matrigel凝固。在TranswellTM小室中加入500 ul DMEM，并在每個小室中加入200 ul細胞懸液進行處理，培養24 h將小室取出，使用PBS溶液洗滌2～3次，擦凈未侵襲的細胞晾干，結晶紫染色5～6 min，再使用蒸餾水漂洗，顯微鏡下觀察。

1.4 統計學方法

應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃癸素促進MCF-7細胞STATS及AKT的表達

圖1顯示，黃癸素可明顯上調STAT3及AKT的表達。

圖1

2.2 黃癸素對MCF-7細胞遷移能力的影響

圖2、3顯示，對照組平均劃痕率(46.27%± 2.61%)，黃癸素組平均劃痕率(98.15%± 3.96%)，黃癸素聯合DMSO組平均劃痕率(91.46%±1.23%)，黃癸素聯合JAK/STAT3平均劃痕率(79.63%±3.47%)及黃癸素聯合PI3K/ AKT組平均劃痕率(69.83%±5.21%)。與對照組比較，各組平均劃痕率均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖2 0h

2.3 黃癸素對MCF-7細胞侵襲能力的影響

圖4顯示，對照組穿膜細胞數為(286±42)，黃癸素組穿膜細胞數為(616±25)，黃癸素聯合DMSO組穿膜細胞數為(571±34)，黃癸素聯合JAK/ STAT3穿膜細胞數為(528±14)及黃癸素聯合PI3K/AKT組穿膜細胞數為(325±18)。與對照組比較，各組穿膜細胞數均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖3 36h

圖4 黃癸素對MCF-7細胞侵襲能力的影響

3 討論

乳腺癌是對女性健康嚴重威脅的一種常見惡性腫瘤［6-8］，其發生發展與多種基因表達的異常密切相關，主要為抑癌基因的失活及原癌基因的激活［9-10］。黃癸素先導化合物小檗堿常見于對細菌性痢疾及腸道感染的治療［11］。近年來研究報道顯示，小檗堿還能夠抑制多種腫瘤細胞增殖，促進其分化，同時還能夠誘導凋亡［12］。同時研究顯示，中藥及其成分可促進人乳腺癌MCF-7細胞遷移及侵襲［13］。研究發現，瘦素可促進乳腺癌轉移、侵襲以及新生血管生成等［14-15］。本文主要研究黃癸素對MCF-7細胞侵襲及遷移作用。結果表明，黃癸素可促進MCF-7細胞的遷移力，JAK/STAT3信號通路抑制劑AG490及PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002可抑制黃癸素對MCF-7細胞的促遷移作用，且與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05);同時黃癸素還可促進MCF-7的侵襲能力，PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002可抑制黃癸素對MCF-7的促侵襲作用，且與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。由此可知，黃癸素促進MCF-7細胞的侵襲特性主要與PI3K/AKT及JAK/STAT3信號通路有一定關系。

綜上所述，黃癸素對MCF-7細胞的促遷移作用與PI3K/AKT及JAK/STAT3信號通路及促進MCF-7細胞的侵襲特性與JAK/STAT3信號通路有關，故黃癸素可通過JAK/STAT3及PI3K/AKT促進MCF-7細胞的遷移及侵襲。

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Analysis of the Mechanism of Berberine on Migration and Invasion of Human Breast Cancer Cell Line MCF-7

ZHENG Chun-Yan
(The affiliated Hospital of Hubei University of TCM，Wuhan 430061，China)

Objective:To investigate Berberine α-hydroxy β-decanoylethyl sulfonate(HB)MCF-7 human breast cancer cell migration and invasion mechanisms.Methods:Western blot assay HB on MCF-7 cell signaling pathways STAT3 and AKT expression，using influence cell scratch assay HB on MCF-7 cell migration and the use of TranswellTM cell invasion assay HB on MCF-7 affect the ability of cell invasion.Results:Huang Kuei factors can significantly upregulate the expression of STAT3 and AKT’s;Huang Kuei hormone group，HB joint DMSO group，HB joint JAK/STAT3 group，HB joint PI3K/AKT group average scratches rate compared with control group，with a significant difference;HB hormone can promote MCF-7 cell migration force，JAK/STAT3 signaling pathway inhibitor AG490 and PI3K/AKT signaling pathway inhibitor LY294002 inhibits migration of HB promoting hormone on MCF-7 cells.HB hormone group，HB joint DMSO group，HB joint JAK/STAT3 group，HB joint PI3K/AKT group penetrating cells compared with control group，with a significant difference.HB hormone can promote the pro-invasion of MCF-7 cells.Conclusion:HB promote migration of MCF-7 cells of the PI3K/AKT signaling pathway and JAK/STAT3 HB-promoting properties of MCF-7 cell invasion and JAK/STAT3 signaling pathway.

Berberine α-hydroxy β-decanoylethyl sulfonate;Breast cancer MCF-7 cells;Migration;Invasion; Mechanism

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0546-03

2015-02-06

鄭春艷(1978-)，女，湖北武漢人，主治醫師，從事中西醫結合乳房疾病的臨床與研究。