海州常山腋芽誘導培養初探

摘 要 以海州常山的1年生莖段為外植體，比較不同消毒劑、消毒時間的消毒效果。消毒后的莖段接種到附加了不同濃度的6-BA和IAA的MS培養基中，篩選腋芽抽生的適宜生長調節劑濃度組合。結果表明：外植體消毒的最佳方案是75%酒精30 s+0.1%HgCl2消毒7 min，有效材料獲得率高達62.0%。在誘導腋芽抽生培養中，以培養基“MS+6-BA 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L”的配方效果最佳，腋芽萌動率高達90.9%。

關鍵詞 海州常山；組織培養；莖段；外植體消毒；腋芽抽生

中圖分類號：S56；Q945.51 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2015）22-083-03

知網出版網址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20150908.1436.048.html 網絡出版時間：2015/9/8 14：36：58

海州常山（Clerodendrum trichotomum Thuhb）別名斑鳩菜、泡花樹，因葉大有特殊臭氣，又叫臭梧桐，為馬鞭草科（Verbenaceae）大青屬（Clerodendrum）落葉灌木或小喬木[1]。海州常山是一種風味獨特的木本野生蔬菜，又是應用很廣的藥用植物，在中藥材市場上的用量很大。此外，海州常山一株樹上花果共存，而且花果期長，色澤亮麗，為良好的觀花、觀果園林植物；具有一定抗旱、耐淹、耐澇和抗污染的能力，對重金屬砷的耐受性和富集能力都較強，是砷污染地的理想修復樹種[2-3]。

海州常山市場需求量大，具有廣泛的開發利用前景，但種苗繁殖難是規模化種植的一個制約因素。由于扦插和分株的繁殖系數低，而種子發芽較困難，因此，組培快繁體系的建立，對海州常山種質資源保護及規模化人工種植都具有重要意義。

1材料與方法

1.1植物材料

試驗材料為海州常山1年生帶腋芽莖段，取材于云南省楚雄市彝人古鎮。

1.2方法

1.2.1外植體消毒

將海州常山枝條去掉葉片，留葉柄0.2 cm左后，以保護腋芽免受機械損傷，先用洗衣粉液進行清洗，然后流水沖洗5 h左后。沖凈后置于超凈工作臺上紫外燈照射10 min，后用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗2次，再根據設計的消毒試驗方案（表1）進行消毒，在消毒液中加入2滴吐溫20。倒去消毒液，用無菌水漂洗5～7次，吸干水分，將消毒后的莖段置于無菌濾紙，切去基部受損組織，接種于培養基上。通過對比不同消毒劑以及不同消毒時間的消毒效果，篩選合適的消毒劑及最佳消毒時間。

1.2.2初代培養

篩選最佳消毒劑及最佳消毒時間，參考劉慧春等人的方法[4]，采用MS+BA0.2+IAA0.1培養基。誘導海州常山腋芽抽生，以MS為基本培養基，添加不同濃度的6-BA、IAA作為外源生長調節劑，共設計8種濃度配比（見表2）。附加3%蔗糖、0.7%瓊脂，pH=6.0。將配制好的培養基置于121℃、0.12 MPa壓力下高溫滅菌30 min，培養溫度為23～25℃，光照度1500～2000 lx，光照12 h/d。

1.2.3數據處理

對外植體消毒后的污染率、存活率及腋芽萌動率進行統計[5-6]，每處理重復3次，統計公式如下。

污染率=（污染的外植體數/接種外植體數）×100%

存活率=（消毒后存活的外植體數/接種外植體數）×100%

腋芽萌動率=（腋芽已萌動的外植體數/接種存活的總外植體數）×100%

2結果與分析

2.1最適消毒劑及消毒時間的篩選

本試驗采用75%酒精處理30 s后，分別用0.1%HgCl2、5%NaClO對外植體進行不同時間的消毒處理。結果表明，不同消毒劑、不同消毒時間對海州常山莖段消毒效果表現不一，其污染率和存活率有所不同，試驗結果見表3。

莖段用75%酒精30 s+0.1%HgCl2消毒5 min時，污染率為48.6%，消毒后莖段褐化輕，后期長勢好，芽萌動快，抽生葉片為深綠色（圖1a）；消毒7 min時，莖段稍有褐化現象，但后期恢復快，整體長勢好，存活率高達62%，消毒效果最好（圖1b、圖2）；消毒10 min時，外植體汞中毒較深，部分外植體褐化死亡，腋芽后期抽生緩慢（圖1c）；當消毒15 min時，汞中毒很深，60%以上的外植體褐化死亡，存活率僅有30%，腋芽抽生極為緩慢。

莖段用75%酒精30 s+5%NaClO消毒3 min時，無褐化現象，接種160個莖段，僅有4個莖段存活，污染率為97.5%，存活率為2.5%；當消毒7 min時，莖段褐化非常嚴重，70%的外植體因褐化死亡，存活率僅有15%，且后期腋芽抽生困難；而消毒時間為5 min時，效果最好，存活率最高達30%，后期腋芽抽生相對緩慢。

綜合上述試驗結果，海州常山外植體（莖段）進行消毒最適方案為75%酒精30 s+0.1%HgCl2消毒7 min，污染率低，存活率最高。

2.2誘導海州常山腋芽抽生培養基的篩選

以篩選出的適宜消毒方法，75%酒精30 s+0.1%HgCl2消毒7 min，設計8個不同濃度配比的培養基（見表2），試驗結果表明，生長調節劑的不同濃度配比對誘導海州常山腋芽抽生效果表現不一，其7 d液芽萌動率跟15 d腋芽萌動率均有所不同（見表4）。

分析7 d和15 d的腋芽抽生情況，其中5號、6號、7號、8號培養基腋芽抽生相對緩慢，1號、2號、3號、4號培養基腋芽抽生相對較快，故6-BA濃度為0.2 mg/L最佳；1號、2號、3號、4號培養基腋芽萌動率以1號、2號較高，1號最高，故低濃度的IAA更有助于腋芽的抽生。所以1號培養基“MS+BA0.2+IAA0.1”為誘導海州常山腋芽抽生的最佳培養基。

3討論

3.1防止褐變的方法

褐變在海州常山組培過程中普遍存在，能否有效控制褐變是決定組培成功的關鍵。可以采取以下防止方法。

（1）通常取幼齡部位進行組織培養不易褐變，但隨著組織的老齡化，植物組織內醌類物質增多而褐變嚴重[7]，選擇外植體時應盡量選擇腋芽飽滿、無病蟲害的1年生枝條。

（2）春夏季特別是春季取材的褐變情況較輕，外植體生長旺盛，分生能力強且不易褐變，而以已經木栓化或木質化的枝條和處于休眠狀態的芽作為外植體進行組織培養時則褐變嚴重，因此組培盡量在春季進行并選擇半木質化枝條。

（3）外植體受傷程度較小時褐變更易控制[8]，所以平常取材時應盡量減少傷口面，保持材料的完整性。

（4）適當添加抗氧化劑及吸附劑，前者抑制多酚氧化，后者吸附氧化物，從而減輕對組織培養物的毒害。

3.2選擇合適的消毒方案

對大多數外植體只需要進行表面消毒即可，外植體表面消毒的關鍵在于選擇合適的消毒劑和消毒時間。不同植物或同一植物不同外植體消毒的方法不同，本試驗中所采取的7種不同消毒方式，其消毒結果存在明顯差異，所以為達到滿意的消毒效果，需根據外植體情況，選擇多種類消毒方式進行試驗，摸索出適宜的消毒劑及最佳消毒時間。

3.3誘導海州常山腋芽抽生的最佳生長調節劑配比

試驗結果表明，低濃度的6-BA與低濃度的IAA更有助于腋芽的抽生。最適培養基為1號“MS+BA0.2+IAA0.1”，此試驗結果與劉慧春[4]等人在豆腐柴組培試驗中的結果一致，低濃度的生長調節劑配比更有利于腋芽抽生。

4小結

綜合上述試驗結果，初步確立海州常山外植體（莖段）消毒處理的最適方案為75%酒精30 s+0.1%HgCl2消毒7 min，污染率低，存活率最高。誘導腋芽抽生1號培養基速度最快，15 d腋芽萌動率最高，高達90.9%，所以“MS+BA0.2+IAA0.1”為誘導海州常山腋芽抽生的最佳培養基。

參考文獻：

[1]曾現艷.海州常山種質資源遺傳多樣性的初步研究[D].濟南：山東農業大學，2011.

[2]謝福春.海州常山的生長特性與抗逆性研究[D].濟南：山東農業大學，2009.

[3]Mahmud R，Inoue N，Kasajima SY，et al.Assessment of potentia1 indigenous plant species for the Phytoremediation of Arsenic-contaminated areas of Bangladesh[J].International Journal of Phytoremediation，2008，10（2）：117-130.

[4]劉慧春，朱開元，金關榮，等.豆腐柴的組織培養與快速繁殖[J].浙江農業科學，2008，（1）：30-31.

[5]于婷喬.藍果忍冬組培快繁技術的研究[D].哈爾濱：東北農業大學，2014.

[6]王樹芝，劉德華，劉黎，等.冬青苦丁茶樹組織培養的研究[J].湖南農業科學，2009，（2）：131-133.

[7]李佳，趙文龍，周長艷，等.蓮藕愈傷組織誘導及組織學觀察[J].湖北農業科學，2014，53（3）：701-703，717.

[8]Bonga J M，Durzan D J著.闕國寧譯.樹木組織培養[M].北京：中國林業出版社，1988：25-26.

（責任編輯：丁志祥）