蚤休復方對T N B S誘導炎癥性腸病小鼠的治療作用及其機制研究

王 卯 陳玉根 楊柏霖 王 瓊 周錦勇 吳 靜

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京210029）

炎癥性腸病 （Inflammatory bowel disease，IBD）是一種病因尚不明確的慢性非特異性腸道炎癥性病變，包括潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩病（CD）。近年來，IBD發病率呈上升趨勢，大部分IBD患者需終身治療，而臨床主要治療藥物如糖皮質激素、氨基水楊酸、免疫抑制劑和抗腫瘤壞死因子抗體副作用較多，多數患者不能長期堅持治療，導致疾病復發和進展[1-2]。因此，開發安全有效的IBD新藥具有重要意義。國醫大師徐景藩教授是學貫中西的臨床大家，他充分了解炎癥性腸病發病機制及病程，在辨證論治的基礎上，對于病程較長，反復腹痛、腹瀉、發熱，反復出現腸梗阻等并發癥，以及腸鏡提示腸腔狹窄的病例每多選用蚤休、青蒿、鴨跖草、紫草、露蜂房、白芷、地錦草等藥，取得了較好的療效。本研究總結徐景藩教授治療炎癥性腸病經驗方蚤休復方，利用三硝基苯碳酸（TNBS）誘導建立小鼠IBD模型，采用臨床治療IBD常規用藥柳氮磺吡啶作為對照，研究蚤休復方對炎癥性腸病的治療作用及其作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥物與試劑 蚤休復方提取物 （蚤休∶青蒿∶鴨跖草∶紫草∶地錦草∶露蜂房∶白芷=2∶3∶6∶3∶3∶2∶2）由江蘇省中醫院制劑部提供。將所有藥材 （15劑，約1600g）加入約10倍量水中浸潤30min，分2次水煮提取。第1次煮沸后在微沸狀態下煎煮60min，過濾得濾液；剩余藥渣再次加入10倍量水微沸狀態下煎煮40min，過濾得濾液；合并2次濾液，加熱濃縮至體積約1500mL，得濃度為1g生藥/mL的濃縮水提物，分裝，4℃條件下保存待用。三硝基苯磺酸（Picrylsulfonic acid solution，TNBS），SIGMA 公 司 ；柳氮磺吡啶，上海中西三維藥業有限公司；便隱血（OB）試劑盒，珠海貝索生物技術有限公司；MILLIPLEXRMAP的小鼠細胞因子/趨化因子磁珠試劑盒，美國Millipore公司。

1.2 實驗動物 BALB/c小鼠80只，18～22g，雌雄各半，由揚州大學比較醫學中心提供，動物合格證號：SCXK（蘇）2012-0004。

1.3 實驗儀器 MAGPIX多重磁珠酶免分析平臺，美國Millipore公司。

2 實驗方法

2.1 小鼠實驗分組及模型建立 80只小鼠隨機分為4組（n=20）：正常對照組、模型組、柳氮磺吡啶組和蚤休復方組。正常對照組不造模，正常飼養。模型組、柳氮磺吡啶組、蚤休復方組小鼠參照文獻[3]方法，于實驗前剃毛，皮膚外涂TNBS 3.75mg（48%乙醇溶解），分別于外涂TNBS后的第7、14、21天直腸給予 TNBS 0.75mg、1.5mg、2.25mg（40%乙醇溶解），誘導IBD小鼠模型。

2.2 藥物干預 藥物干預與造模同時進行。蚤休復方組給予10g/kg蚤休復方提取物灌胃，柳氮磺吡啶組給予0.5g/kg柳氮磺吡啶灌胃，正常對照組和模型組給予等量生理鹽水，每日1次，連續灌胃給藥28d。

2.3 觀察指標 每日記錄小鼠體重、糞便性狀、便隱血，參考文獻[4]方法，對小鼠進行疾病活動指數（DAI）評分，并記錄死亡情況。實驗結束時處死小鼠，取結直腸稱重，測量長度和重量。取結直腸組織進行結腸炎癥病理評分，隨后10%福爾馬林固定，常規取材，脫水，石蠟包埋，切片經蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡觀察，參考文獻評判標準進行結腸炎癥組織病理學評分[5]。小鼠取血，利用多水平自動化和高通量的磁珠法篩選，即以MILLIPLEXR MAP的小鼠細胞因子/趨化因子磁珠試劑盒定量檢測32種細胞因子和趨化因子。

2.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠存活率比較 正常對照組小鼠實驗過程中未出現死亡，存活率為100%；模型組小鼠終點生存率為70%，與正常對照組比較具有統計學差異（P=0.02683）；柳氮磺吡啶組及蚤休復方組小鼠終點生存率均較模型組高，但差異均無統計學意義。見表1。

表1 各組小鼠存活率比較

3.2 各組小鼠結腸重量/長度比值比較 TNBS誘導的IBD模型小鼠結腸重量/長度的比值升高，與正常對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）；柳氮磺吡啶能顯著降低IBD模型小鼠升高的結腸重量/長度比值（P＜0.01）；蚤休復方組結腸重量/長度比值較模型組降低，但差異無統計學意義。見表2。

表2 各組小鼠結腸重量/長度比值比較

3.3 各組小鼠疾病活動指數比較 TNBS誘導的IBD模型小鼠DAI指數較正常對照組明顯升高（P＜0.01）；柳氮磺吡啶和蚤休復方組小鼠DAI指數顯著低于模型組（P＜0.01，P＜0.05）。見表 3。

表3 各組小鼠疾病活動指數比較

3.4 各組小鼠結腸病變情況及病理評分比較 如圖1所示，正常對照組小鼠結腸未見明顯病變；模型組小鼠結腸炎癥嚴重程度為輕度或中度，多數累及黏膜層和黏膜下層，個別累及肌層，多數見隱窩損害；柳氮磺吡啶組結腸炎癥嚴重程度較模型組明顯減輕，病變均局限于黏膜層，無隱窩損害；蚤休復方組結腸炎癥較模型組減輕，炎細胞類型同前，病變均局限于黏膜層，均無隱窩損害。病理評分結果見表4。與正常對照組比較，模型組小鼠病理評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，柳氮磺吡啶組和蚤休復方組小鼠病理評分均明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。

圖1 各組小鼠結腸病理圖片（HE染色，×200）

表4 各組小鼠病理評分比較 分

3.5 各組小鼠細胞因子血清水平比較 檢測了32種細胞因子和趨化因子，與模型組比較，蚤休復方組小鼠血清IL-12 P70明顯增加 （P=0.030），CCR5配體 MIP-1ɑ明顯減少（P=0.045），而 CXCR3配體CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）血清水平顯著增加（P=0.006，P=0.027）。

表5 各組小鼠IL-12 P70、IP-10、MIP-1ɑ及MIG表達水平比較

4 討論

目前炎癥性腸病的發病原因及機制尚不明確，一般認為可能與免疫、感染、環境、遺傳等多種因素相關。西醫治療IBD以控制炎癥、緩解癥狀為主，多采用氨基水楊酸類藥物，如柳氮磺吡啶，主要有效成分為5-氨基水楊酸，與腸壁結締組織絡合后較長時間停留在腸壁組織中起到抗菌消炎和免疫抑制作用，同時抑制前列腺素的合成以及其他炎癥介質白三烯的合成。此法有一定療效，但不良反應較大，復發率高。

徐景藩教授認為，炎癥性腸病的主要病因病機為“熱毒”。濕熱蘊結腸腑，久而化火釀毒，阻滯氣血，不通則痛；熱毒壅盛，肉腐成膿，內潰成瘍；入營動血，迫血妄行，下痢膿血。在辨證論治的基礎上，徐老多選用蚤休、鴨跖草、紫草清熱涼血解毒，青蒿、地錦草清熱利濕，露蜂房攻毒止痛，白芷燥濕排膿，諸藥共奏清熱解毒、利濕斂瘍之效。

TNBS誘導以免疫介導的腸道炎癥模型，引起的免疫應答以Th1為主，病變特點與炎癥性腸病類似[6]。本研究采用TNBS誘導小鼠IBD模型，動物存活率70%，可滿足研究需要。模型小鼠結腸重量/長度的比值、疾病活動指數以及病理評分均升高，與正常對照組比較有顯著性差異（P＜0.01），表明TNBS誘導的IBD模型較好地體現了IBD從急性炎癥向慢性炎癥轉化的動態過程，適用于IBD中藥復方的藥效學評價。與模型組相比，蚤休復方組小鼠存活率增高，IBD疾病活動指數明顯降低，結腸重量/長度比值降低，結腸病理評分明顯降低，小鼠結直腸炎癥水腫改善，結腸組織炎癥和隱窩損害明顯減輕降低。上述結果共同提示蚤休復方提取物能減輕TNBS誘導的小鼠炎癥性腸病癥狀，具有較好的治療作用。

免疫因素，尤其是腸道免疫系統的調節異常，是IBD非常重要的發病原因及機制之一，細胞因子在機體免疫應答中具有重要作用。本研究檢測了小鼠多種主要細胞因子含量的變化，結果發現與模型組相比，蚤休復方組小鼠CCR5配體MIP-1ɑ明顯減少（P=0.045），而 CXCR3 配體 CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）的血清水平顯著增加（P=0.006，P=0.027）。有研究表明，MIP-1ɑ增加會加重BALB/c實驗小鼠的結腸炎，其會顯著增加小鼠發生穿透性潰瘍的風險[7]。Toll樣受體（TLR）與炎癥性腸病密切相關，特別是TLR3和TLR4。TLR一旦識別并結合PAMP（病原相關分子模式，如LPS）就會導致下游信號事件和轉錄因子的協調激活，從而誘導抗微生物、化學趨化因子、細胞因子和共刺激因子的表達。TLR4與干擾素協同，調節趨化因子的生成，如MIG[8]。通過與其受體CXCR3結合，MIG吸引CD4+和CD8+T細胞，并激發宿主的炎癥反應。有研究提出，激活TLR通路可緩解炎癥性腸病小鼠腸道炎癥[9]。亦有研究發現，靜脈應用TLR配體既可呈現促炎作用，也可呈現抗炎作用，這取決于何種配體處于優勢水平[10]。TLR4激動劑可刺激大量產生IP-10。IP-10是不同細胞對IFN-γ、微生物成分應答后產生的CXC化學激活因子，可對單核細胞、NK細胞產生化學吸附作用，更重要的是Th1型細胞優先表達IP-10受體CXCR3[11]。TLR4的活化促進炎癥前介質的釋放，有助于白細胞的遷移浸潤，激活天然免疫和獲得性免疫系統，增強組織纖維化[12]。本項研究結果提示，蚤休復方中單體成分可能與IFN-γ協同刺激巨噬細胞產生CXCL9（MIG）、CXCL10（IP-10）等因子，進而影響 T 細胞活化、趨化，具有類TLR4激動劑作用。蚤休復方調節免疫應答的具體分子機制及活性單體成分有待進一步研究。

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