中國東北人群中轉化生長因子-α基因rs3771494單核苷酸多態性與非綜合征唇腭裂的關系*

胥威 盧永平 韓維田 宋方田

非綜合征唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）是指不伴有其他先天畸形的唇腭裂，是人類最常見的先天性畸形之一，是一種遺傳、環境因素及兩者相互作用所致的多基因多因素遺傳疾病[1-5]。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）是新一代遺傳標記，由于其密度高、遺傳穩定性好、具有代表性、分析易自動化等特性成為第3代基因遺傳標記，被認為是影響人類疾病易感性和藥物反應的決定性因素[6]。在臨床工作中，可以利用單核苷酸多態性這種最新的遺傳標記尋找疾病的致病基因，診斷及預測疾病發生風險。其中，首次被提出的易感基因是轉化生長因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）基因（定位于2p13），有研究證實TGF-α基因Tag I的特定C2等位基因與非綜合征唇腭裂有關系，而隨后有部分學者則沒有得到類似的結論。目前，已經發現了TGF-α基因的356個SNP和20個插入/缺失與非綜合征唇腭裂的發病相關[7]。由于地區環境和種族差異的影響，該基因在不同文獻的結果也有所區別。本研究以東北地區236例非綜合征唇腭裂患者及400例正常人為研究對象，用基因芯片的方法檢測TGF-α基因rs3771494多態性，用以分析東北地區人群非綜合征唇腭裂與TGF-α基因多態性的相關性，現具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008-2012年在中國醫科大學附屬口腔醫院就診治療的非綜合征唇腭裂患者236例作為病例組，排除其他系統畸形及綜合征唇腭裂，包括先天性心臟病伴唇腭裂、范伍德綜合征、腭心面綜合征及歌舞伎面綜合征等。非綜合征唇腭裂患者年齡1~35歲，平均（9.96±6.84）歲。其中男127例，女109例，男女比例為1.17：1。正常對照400例，年齡3~36歲，平均（10.12±7.67）歲，其中男215例，女185例，男女比例為1.16∶1。病例組及對照組樣本均為東北地區人，均簽署了知情同意書。

1.2 儀器與試劑 點樣儀（Nano-Plotter 2.1，GeSiM，德國），GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀（Axon Instruments，USA）；TIANamp血 液 DNA 提 取 試劑 盒（TIANGEN）；TGF-α 基 因 PCR擴 增 引物： 上 游：TCACTTCCCCTTTTTCATCTG， 下 游：CGAGGAGGCTCCTGAGGTG（金斯瑞生物科技有限公司合成），產物長度為179 bp。DNA聚合酶采用NEB的vent DNA聚合酶。EXOI（Takara），堿性磷酸酶（Takara）。芯片的制備及基因型檢測所用探針和特異性延伸引物及陽性對照（南京生物科技有限公司合成）見表1。

表1 TGF-α基因rs3771494位點的探針和特異性延伸引物

1.3 方法 全基因組DNA提取、PCR擴增、特異性引物延伸、雜交及基因芯片結果掃描。所有患者抽取靜脈血5 mL，EDTA抗凝，-20 ℃凍存備用。所有患者均取500 μL外周血，利用TIANGEN全基因組核酸提取試劑盒提取白細胞全基因組DNA后，進行PCR擴增，反應在20 μL中進行，其中包括基因組DNA 2.5 ng， 引 物 0.4 μM，dNTP 0.125 mM，1×buffer，ventDNA聚合酶0.05 U；PCR循環條件為94 ℃變性5 min，然后 94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，循環35次，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃終止延伸。PCR產物進行特異性引物延伸，體系為15 μL：5 μL PCR產物，0.02 U ventR（exo-）DNA聚合酶，0.375 μL dATP，0.375 μL dTTP，0.375 μL dGTP，0.375 μL Cy3-dCTP，0.025 μM特異性延伸引物。延伸產物與預先準備好的芯片雜交，洗后用共聚焦激光掃描儀（GenePix 4000 B）掃描結果。GenePix 6.0讀取每條探針的熒光信號強度值。基因型通過計算每個位點的等位基因分數（AF）讀取，AF=等位基因B/（等位基因A+等位基因B）。AF<0.4，0.4≤AF≤0.6及AF>0.6分別為等位基因A純合子，雜合子AB及等位基因B純合子。通過計算結果讀取基因型。

1.4 統計學處理 所得數據采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

病例組基因型TC、CC及TC+CC的頻率均高于對照組，比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 TGF-α基因rs3771494位點的基因分布情況及其分析 例（%）

3 討論

唇腭裂是最為常見的顏面部畸形，其發病率約0.018%，位居圍產兒出生缺陷的第4位，屬多基因遺傳病，男多于女[8]。近年來，有關唇腭裂的基因定位研究是該領域的一個熱點，國內外學者已做了大量的研究工作，提出了相關的染色體易感位點：3p21.2、6p23-p25、16p13.3（MMP25）、2p13 和 16q22-q24等；易感基因：TGF-α、TGF-β、MSX1、MTHFR、RARA、BCL3和IRF6等[9]。其中TGF-α基因是迄今為止發現的最有價值的與非綜合征唇腭裂致病有關的基因之一[10-14]。

面部胚胎發育包括神經嵴細胞的發育和遷移，腮弓的形成，幾個面突的出現、運動和相互融合等幾個連續的過程，同時受生長因子（表皮生長因子和轉化生長因子等）和甾類/甲狀腺/視黃酸超家族的調控，其中任何一個過程和參與調控的因子的作用受到干擾，都可能導致唇腭裂的發生。TGF-α是一種多肽類生長因子，為人表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）家族的重要成員，具有多種生物學活性，它能激活受體上的酪氨酸激酶，激活MAPK信號系統（Raf-MEK-ERK），ERK通路激活后，信號傳導因子細胞外調節蛋白激酶（ERK）進入細胞核，引起轉錄因子的磷酸化，導致細胞增殖。因此認為可能是TGF-α基因多態性改變了TGF-α的空間結構、組織表達及TGF-α在腭突組織中正常的表達，從而影響唇腭的正常發育。有研究表明在胚胎發育，特別是腭突的抬起和融合的關鍵時期，小鼠腭突組織廣泛表達TGF-α[15]。因此圍繞著TGF-α基因結構、功能與非綜合征唇腭裂發生之間的關聯性的研究成為近些年來研究的熱點。TGF-α基因研究最多的是TaqI、RsaI、C3296T、Primer P、BamHI和PrimerK等位點[16]。本研究就rs3771494位點的多態性與中國東北人群非綜合征唇腭裂的關系進行了分析，發現病例組基因型TC、CC及TC+CC的頻率均高于對照組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。說明在中國東北人群中TGF-α基因rs3771494位點基因型TC和CC與非綜合征唇腭裂的發病密切相關。有研究采用病例對照分析方法，只發現TGF-α基因rs3771494位點與中國部分地區人群非綜合征唇腭裂的發生有關。不同研究結果的差異可能與研究人群的種族及樣本量有關系。

環境因素在非綜合征唇腭裂的發病中也起著非常重要的作用[17]。Van Rooij等[18]證實母親為MTHFR 677TT基因型且孕期未服用葉酸或服用葉酸的劑量較低，其后代患唇腭裂的風險較高；母親為MTHFR 1298CC且孕期未服用葉酸或服用葉酸的劑量較低，其后代患有唇腭裂的風險較正常者高7倍。另外，國內外大量學者做了大量的臨床和實驗研究篩選了可能的易感性基因以及進行基因定位，到目前為止大約有20多個候選基因被發現，主要集中在TGFA、TGFB3、FR-3、MTHFR、MSX-1、BCL-3、RARA、F13A、ARNT2、EPHX1等基因和基因位點上，但不同種族、不同地區甚至不同表型非綜合征唇腭裂的候選基因位點都有很大的差異性，多數結果重復性差，這些候選基因大部分仍有待于進一步研究篩選。本研究中，證實TGF-α基因rs3771494位點與中國東北人群非綜合征唇腭裂的發病密切相關，將來，應該進一步同時結合多個基因和環境因素的相互作用對非綜合征唇腭裂的發病進行更深入的分析，進一步闡明唇腭裂的發病機制和因素，為預防唇腭裂的發生做準備。

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