鄭州地區秋冬季腹瀉患兒輪狀病毒基因分型及干預研究*

王艷麗 杜遠舉 李春力 程艷波

輪狀病毒（rotavirus，RV）由澳大利亞科學家Bishop等在1973年首次發現，是引起嬰幼兒感染性腹瀉的主要病原體。據世界衛生組織2008年統計，RV感染造成45.3萬（42.0~49.4萬）幼童死亡，在發展中國家，小兒腹瀉常常是嬰幼兒死亡的主要原因，僅次于肺炎，排在第2位[1]。大約90%的RV感染相關死亡病例發生在亞洲和非洲的發展中國家[2]。我國每年有4萬嬰幼兒因RV性腹瀉而死亡[3]。RV感染普遍，目前尚無治療RV腹瀉的特效藥，主要采用對癥治療，糾正脫水，維持電解質平衡，因此預防極其重要[4]。

目前由于RV的型別眾多且多變，其流行病學相當復雜，在不同地區不同時期的流行株各不相同，因此有必要建立廣泛的RV監測網，動態監測RV流行株的變化，從而為疫苗研發提供數據支持。鄭州地區為北溫帶大陸性季風氣候，冷暖適中，四季分明，也是我國RV流行的代表性地區之一，流行高峰一般在9-12月份。本研究選擇常見的6種A組RVVP7基因型（G基因型）特異引物和5種A組RVVP4基因型（P基因型）特異引物，采用RT-PCR及net-PCR技術對鄭州地區嬰幼兒A組RV腹瀉進行P和G基因型的分子流行病學研究，并探討使用RV干預后再次感染患兒的血清分型及臨床癥狀嚴重程度的關系，為研制適合本地區的安全有效的RV疫苗提供流行病學依據.并對RV的流行病學檢測提供科學數據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年9月-2012年3月、2012年9月-2013年3月鄭州市第一人民醫院和鄭州人民醫院兒科住院部和門診秋冬季腹瀉患兒共900例。其中2011年9月-2012年3月500份，2012年9月-2013年3月400份，均符合以下臨床診斷標準：（1）年齡<5歲，大便次數增多，呈水樣、蛋花湯樣便或稀糊狀、黃綠色稀便，無黏液及膿血[5]。（2）標本逐月收集，詳細記錄腹瀉患兒口服輪狀病毒疫苗史及免疫調節劑（如干擾素、免疫球蛋白）使用史。（3）所有標本存于-70 ℃冰柜備用，詳細記錄每例患兒腹瀉的臨床表現（發熱程度、每日腹瀉次數、有無嘔吐、有無脫水癥狀及脫水癥狀的輕重）、療程以及有無合并呼吸道感染癥狀。

1.2 主要試劑 A群RV診斷試劑盒（購自衛生部蘭州生物制品研究所），小量柱離心式/液體樣品RNA/DNA抽提試劑盒（購自上海華舜工程有限公司），PCR擴增試劑（均購自寶生物工程大連有限公司），PCR產物鑒定利用瓊脂糖凝膠電泳法。

1.3 試驗方法 （1）RV的RNA提取及檢測：采用酶聯免疫吸附試驗方法（ELISA）檢測RV抗原，其操作步驟嚴格按照試劑盒操作：檢測陽性標本用病毒/液體樣品的RNA/DNA抽提試劑盒（購自上海華舜工程有限公司）抽提RNA，將裝有RVRNA的1.5 mL離心管置于-70 ℃冰柜備用。（2）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）擴增RV的VP7全長基因及巢式-聚合酶鏈反應（net-PCR）VP7血清型分型。分型方法見參考文獻[6]。（3）巢式-聚合酶鏈反應（net-PCR）進行VP4血清型分型，分型方法見參考文獻[7]。

1.4 統計學處理 數據采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RV檢測結果以及RV感染的年齡和性別分布 通過ELISA方法檢測結果顯示，900份糞便標本中RV陽性樣本為612份，陽性率為68.0%。其中男女患兒比例為2.01∶1，差異無統計學意義（P>0.05）。在7~18月年齡段患兒中RV陽性率最高（73.9%），與其他各年齡段0~6個月（7.0%）、19~36個月（16.3%）、37~60個月（2.8%）的檢出率比較差異有統計學意義（P<0.01）。在輪狀病毒感染病例中，小于2歲患兒所占比例較高，各年度基本一致；其中高發年齡段為6~24個月，平均發病月齡為（10.1±7.2）個月。612份陽性標本中年齡和性別分布見表1。

表1 RV陽性標本年齡與性別分布 例

2.2 不同時間RV感染的時間分布特點 RV腹瀉呈全年發病，2011年9月-2012年3月及2012年9月-2013年3月RV陽性率檢出最高的月份分別為2011年10月和11月，2012年9月和10月。高峰月和其他月份有差異。

2.3 不同時間RV的G血清型和P基因型型別特征 G3型在2011年9月-2012年3月為優勢株，2012年9月-2013年3月G9型成為優勢株，混合感染型每年均有出現。P8在每年的感染中均為優勢株，并發現有混合感染型別， 2011年9月-2012年3月與2012年9月-2013年3月P基因型混合感染比率分別為14.8%和15.0%。具體G血清型和P基因型型別特征見表2、3。

表2 不同時間RV的G血清型分型 份（%）

表3 不同時間RV的P基因型分型 份（%）

2.4 不同時間RV的G血清型和P基因型組合 2011年9月-2012年3月G、P組合以G3P8為主，2012年9月-2013年3月以G9P8型為主。具體G血清型和P基因型的組合見表4。

表4 G血清型、P基因型組合 份

2.5 RV病毒分型與呼吸道感染情況 在612份陽性標本中合并有呼吸道感染的147例，其中G9P8型有67例，占45.6%，其余為混合感染型，其中G1+3P8型、G3+9P8型、G3P8+6型、G1+3P8+4型均有出現。2.6 RV病毒分型及口服輪狀病毒疫苗后再次感染 900份標本中使用輪狀病毒疫苗的患兒共317份，其中612份陽性標本中已使用口服RV疫苗（商品名羅特威，蘭州生物制品研究所有限責任公司生產的口服RV活疫苗）再次受感染的患兒有149例，再感染的患兒149例與未使用輪狀病毒疫苗患兒臨床表現如：腹瀉次數、發熱或輕微發熱及脫水癥狀等情況較未使用輪狀病毒疫苗患兒輕。

3 討論

2011年9月-2012年3月及2012年9月-2013年3月RV檢測結果顯示，鄭州地區秋冬季腹瀉患兒RV陽性率68.0%，其中2011年9月-2012年3月陽性率77.8%，2012年9月-2013年3月RV陽性率55.7%，高于王建陽等[8]2005年10月-2006年10月檢測的RV感染陽性率51.97%及程艷波等[6]2010年鄭州地區監測陽性率50%，與往年相比感染率有所增高。較國內其他城市如北京、上海、廣州等地區高，證明RV仍是引起鄭州地區嬰幼兒腹瀉的主要原因。RV檢出率在男性患兒和女性患兒之間國內報道各有區別。本研究顯示RV陽性率在男女患兒之間無差異。

RV的VP7蛋白是位于其外殼的主要蛋白結構，目前已有27個G血清型和35個P基因型被確定[9]。RV全球范圍內最流行的組合為G1P8、G2P4、G3P8、G4P8、G9P8[10]。而我國不同地區不同時間報道的RV流行株不同，我國20世紀90年代RV感染以G1型為主，2001年以來G3型取代G1型成為成為國內主要流行株[11]。例如廣州地區1994-2001年RV感染以G1型為主，2007年以G3型為主，而2008年轉為以G1型為主[10]。上海地區2001-2007年G基因型以G3為優勢株，G1呈下降趨勢[12]。2008年-2011年G基因型出現變化，G3呈下降趨勢，G9和G1呈波動上升趨勢，尤其G9于2011年成為主要流行株[13]。蘭州地區2001-2007年度RV主要流行株由G3型過渡到G2型，再過渡到近兩年的G1型，可見年份不同流行株不同[14-15]。自1994年國內學者錢淵等[16]首次報道G9型感染病例，近年來國內G9病例陸續出現報道，任斌知等[17]研究太原市嬰幼兒RV腹瀉的分子流行病學特征發現2012年該市RV基因型G9成為主要優勢株。上海于2011年、廣西2010年均檢測到G9并成為該年最主要的流行優勢株[13-17]。本研究顯示鄭州地區2011年9月-2012年3月以G3型為主要流行株，2012年9月-2013年3月則以G9為主要流行株，證實G9作為以前稀少的流行株逐漸成為優勢株，并且在鄭州地區流行中占主導地位。目前RV疫苗主要是針對4個主要的流行優勢株（G1~G4）來控制RV感染，而G9型RV流行越來越普遍，很有可能成為繼G1~G4之后第5種最為流行的血清型，將來的RV疫苗的研制就必須引入所有常見的血清學中的中和抗原，這促使人們重新認識G9型輪狀病毒感染的流行病學意義。本研究還發現G血清型混合感染病例比率2011年9月-2012年3月為13.1%，2012年9月-2013年3月混合感染病例比率15.7%，有升高趨勢。混合感染比率的出現為病毒基因重組所導致流行病毒株血清型改變提供機會，而基因突變是導致病毒株多樣性的主要因素。鄭州地區RV混合感染病例遠高于蘭州地區混合感染比率，與國內其他地區相比也明顯增高，這也說明RV感染比率近兩年逐漸增高可能與基因突變有關。

RVVP4是組成RV的對蛋白酶敏感的非糖基化蛋白，目前引起嬰幼兒腹瀉的P基因型多為P8和P4型，同時也發現了一些不常見的P6型和P9型。最近研究表明P6型可引起嬰幼兒有癥狀的腹瀉，是一種與RV腹瀉有關的蛋白[18]。本研究RVVP4基因分型結果顯示：鄭州地區2011年9月-2012年3月與2012年9月-2013年3月P基因型均以P8型為主，P4型次之，發現P6型比率為5.9%（36/612），低于廣州地區2007年11月-2008年2月的P6比率22.2%[10]，蘭州地區2001-2005年均未發現P6型，2006年發現P6型毒株4例[14]，張玉俠等[19]2006-2008年未發現P6型病例。李丹地等[20]研究河北省盧龍地區2008-2009年RV感染未發現P6型感染病例，發現混合感染病例較多，占28.7%。鄭州地區2011年9月-2012年3月與2012年9月-2013年3月P基因型混合感染比率分別為14.8%和15.0%，較2010年王艷麗等[21]研究該地區混合感染病例增加。目前國內外均檢出高比率的混合型感染病例，證明RV的多樣易變，導致復雜分子流行病學出現，給RV的預防帶來挑戰。

G、P是兩個相對獨立的血清型，相同的G型毒株可有不同的P血清型。不同國家地區，同一地區不同年份流行的P基因型也可不同或出現新的G和P組合類型。隨著檢測方法的不斷改進和流行病學檢測網絡的日臻完善，發現先前認為不致病或很少致病的基因型也能引起嬰幼兒腹瀉。本研究提示鄭州地區2011年9月-2012年3月RV流行病學組合為G3P8型，2012年9月-2013年3月變為G9P8型為主，孫立美等[22]監測廣州地區2012年RV分子型別以G1P8型為主，并發現不常見的G4型。高志勇等[23]監測北京地區2011年RV分子流行型別以G1+G9P8混合型為主。這顯示各地區不同年份RV分子流行病學不斷變化。目前國內各 地都有RV分子流行病學檢測，而鄭州地區既往缺乏RV分子流行病學系統的研究。

RV腹瀉的嚴重程度和RV血清型的相關性研究一直是個熱點。Bern等[24]發現感染G2型毒株患兒的癥狀比感染其他型別毒株患兒的癥狀嚴重，但并沒有對此作出系統的統計學比較。2013年WHO在關于RV疫苗的意見書中提出RV的型別通常與疾病的嚴重程度無關。本課題研究發現在所有研究的RV分型中合并呼吸道感染的病例G9P8型居多，這是否與RVG9型易合并呼吸道感染有關還是與G9P8型毒力強有關，需要進一步的研究證實。

輪狀病毒腹瀉的臨床表現為腹瀉黃綠色稀水樣便，發熱，腹瀉次數及病程較未使用患兒輕，本研究發現使用RV疫苗干預后再次感染的以混合感染病例居多，這表明疫苗有一定的保護作用，但目前疫苗保護具有局限性。曹兵等[25]研究表明我國蘭州羊RV疫苗對RV腹瀉的保護效果為72%，對嚴重RV性腹瀉的保護效果為70%。目前國內對使用疫苗干預再感染的研究報道較少，需要進一步深入研究以了解干預治療后對臨床的影響。

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