東海原甲藻抗體的制備及酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

李成峰 , 甄 毓 劉材材, 秦 超, 馮 明, 王國善, 米鐵柱

(1.中國海洋大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266100; 2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室, 山東青島 266100; 3.國家海洋局 東海環(huán)境監(jiān)測中心 , 上海 200137; 4.東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海201620; 5.上海英基生物科技有限公司, 上海200137; 6.中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266100)

近年來, 面積超過1000 km2, 持續(xù)時間超過一個月的大規(guī)模赤潮時常在我國東海區(qū)域出現(xiàn)[1-3]。東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)屬于甲藻綱(Dinophyceae)、原甲藻目(Prorocentrales)、原甲藻科(Prorocentraceae), 是引發(fā)東海赤潮暴發(fā)的優(yōu)勢藻種之一。在赤潮發(fā)生的早期,藻細(xì)胞密度相對較低且個體微小, 傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡觀察計數(shù)的方法主要用于對藻類的定性和分離, 但這種方法費時、費力、過程繁瑣, 操作要求高, 不適合對赤潮暴發(fā)時大批量海水樣品的檢測。

近十幾年來, 以抗體為基礎(chǔ)的免疫檢測方法逐漸發(fā)展成熟并應(yīng)用于浮游藻類研究。Anderson等[4]制備了抑食金球藻(Aureococcus anophagefferens)的多克隆抗體, 利用免疫熒光技術(shù)研究該藻在美國東北海岸的分布。Nagasaki等、Vrieling等和 Adachi等陸續(xù)制備針對Gymnodinium nagasakiense[5]、Chattonella marina-[6]、Gyrodiniumcf.aureolum[7]和Alexandrium[8]甲藻的單克隆抗體, 實現(xiàn)了對相應(yīng)海藻的定性鑒定和分類。Caron等[9]利用抗A.anophagefferens的特異性單克隆抗體, 建立了快速檢測該藻的酶聯(lián)免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法。Costas等[10]將針對微小亞歷山大藻(A.minutum)的多克隆抗體與磁性微粒結(jié)合, 利用免疫磁性微粒技術(shù)對天然海水樣品中的目的細(xì)胞進(jìn)行分離。亓海剛等[11]建立了應(yīng)用赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)的特異性多克隆抗體檢測該藻的間接ELISA方法。向軍儉等[12]制備了針對赤潮異彎藻(H.akashiwo)、海洋卡盾藻(Chattonella ma-rina)、卵圓褐胞藻(Chattonelia ovata)和具齒原甲藻(Prorocentnmz dentatum)的抗血清, 用間接ELISA檢測發(fā)現(xiàn), 抗血清對各自藻體均有良好的特異性和親和力, 與異種赤潮藻之間交叉反應(yīng)較弱, 表明單種藻免疫獲得的小鼠多克隆抗體可以特異性地與相應(yīng)赤潮藻作用。這些研究表明, 抗體技術(shù)具有操作簡單、精確度高的優(yōu)點, 可以實現(xiàn)對赤潮藻的定性、定量分析, 對海洋環(huán)境監(jiān)控具有重要意義。

目前, 國內(nèi)外并未出現(xiàn)關(guān)于應(yīng)用多克隆、單克隆抗體和酶聯(lián)免疫檢測方法定量檢測東海原甲藻的報道。本研究首次采用針對東海原甲藻制備的單克隆和多克隆抗體, 利用雙抗體 ELISA方法對東海原甲藻進(jìn)行快速定量檢測, 并且對實驗方案進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 藻種培養(yǎng)

東海原甲藻(P.donghaiense)(分離于我國東海海域)、赤潮異彎藻(H.akashiwo)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)、纖細(xì)角毛藻 (C.gracilis)、裸甲藻(Gymnodiniumsp.)、米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)、血紅哈卡藻(Akashiwo sanguinea)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)均由中國海洋大學(xué)提供,培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基, 普通日光燈為光源, 光照/黑暗周期12h/12h, 光照強度4 000 lx, 培養(yǎng)溫度20~25℃。

1.2 免疫原的制備

取適量東海原甲藻樣品(100~500 mL)用 0.45 μm濾膜過濾, 記錄體積。將得到的濾膜放入5 mL離心管, 加入2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS), 超聲波破碎2 min,得到樣品溶液。將樣品溶液與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后作為免疫原備用。

1.3 抗體的制備

1.3.1 多克隆抗體的制備

實驗用純種新西蘭白兔由中科院上海生物工程研究中心動物房提供并飼養(yǎng)。免疫前采血樣作陰性對照, 每2只同種實驗動物為一組, 共設(shè)兩組。選取皮下多點和肌肉注射方式對家兔進(jìn)行免疫。間隔兩周加強免疫。三次免疫后耳動脈取血, ELISA檢測抗體效價。最后一次免疫兩周后頸動脈放血, 4 000 r/min離心5 min分離血清, 收集抗體保存于–20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 單克隆抗體的制備

在1.3.1獲得的高效價多克隆抗體的基礎(chǔ)上, 參照文獻(xiàn)[13]的方法, 經(jīng)過骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備、細(xì)胞融合, 次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全培養(yǎng)液(HAT培養(yǎng)液)的選擇培養(yǎng),用間接ELISA方法特異性篩選細(xì)胞融合的陽性雜交瘤細(xì)胞, 接種到4只小鼠腹腔中, 進(jìn)行抗體制備、純化得到高純度的單克隆抗體。

1.4 ELISA方法試驗條件的優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[14]的方法, 確定酶標(biāo)二抗、單克隆抗體以及多克隆抗體的最佳工作濃度, 封閉液用2%的牛血清蛋白溶液, 選擇37℃封閉2 h作為封閉時間。

雙抗體ELISA方法如下: 將單抗包被于96孔板,4℃包被過夜, 次日洗板; 加入封閉液, 37℃封閉2 h后洗板; 加入待測抗原, 37℃, 1.5 h后洗板; 加入多克隆抗體, 37℃, 1.5 h后洗板; 加入酶標(biāo)二抗溫育45 min,添加TMB顯色液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)和終止液后檢測A450值。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

根據(jù)實驗所得的最佳實驗條件, 用制備的東海原甲藻的單克隆抗體、多克隆抗體和已知濃度藻細(xì)胞(密度分別為 32×103、16×103、8×103、4×103、2×103、0×103個/mL), 用雙抗體ELISA實驗方法進(jìn)行測定。以藻細(xì)胞濃度為橫坐標(biāo),A450為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 確定最小檢出限度。

1.6 模擬樣品的雙抗體ELISA定量檢測

海藻樣品分為兩組: 第一組純種樣品: 將只含有東海原甲藻的培養(yǎng)液稀釋至 104個/mL; 第二組混合樣品: 在多種藻(不含測試的目標(biāo)藻)混合濃度為 104個/mL的培養(yǎng)液中加入要檢驗的目標(biāo)藻, 使目標(biāo)藻濃度約為104個/mL。按1.4確定的最佳工作濃度和步驟進(jìn)行雙抗體 ELISA檢驗, 標(biāo)準(zhǔn)樣品設(shè)置三個平行樣, 選取曲線方程決定系數(shù)R2值大于0.995的作為檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測樣品設(shè)置 10個平行樣,根據(jù)檢測得到的吸光度值計算得到細(xì)胞濃度, 與顯微鏡直接計數(shù)進(jìn)行比較。

1.7 現(xiàn)場樣品的雙抗體ELISA定量檢測

2013年7月至10月, 采集現(xiàn)場樣品(采樣站位如圖1)。圖中 A點是東海赤潮監(jiān)控海區(qū)采樣點(122°36′48″E, 30°49′04″N), 間隔兩周采樣一次。B點是嵊泗海水浴場(南長涂海水浴場)采樣點(122°27′55″E, 30°41′49″N), 每天采樣。樣品處理:取2 L左右樣品, 用0.45 μm的醋酸纖維膜過濾, 得到濾膜, 記錄體積。將得到的濾膜放入5 mL離心管中, 加入 2 mL 磷酸鹽緩沖液, 超聲波破碎 2 min,得到待檢測的樣品溶液, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 現(xiàn)場樣品采樣站位Fig.1 Map of sampling station sites

將待測樣品進(jìn)行雙抗體 ELISA檢驗, 方法和步驟同 1.4, 標(biāo)準(zhǔn)樣品設(shè)置三個平行樣, 根據(jù)檢測得到的吸光度值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞濃度。另取一份樣品進(jìn)行鏡檢, 兩組結(jié)果進(jìn)行比較以驗證檢測結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 抗體效價

圖2和圖3是東海原甲藻多克隆抗體和單克隆抗體的抗血清效價檢測結(jié)果。圖2中兔1、兔2血清中的多克隆抗體在稀釋倍數(shù)<23 000時, 吸光度值均大于 1.0, 具有很高效價。陰性對照 1和陰性對照2的吸光度值均小于 0.4, 與抗體的試驗結(jié)果存在明顯差異, 影響不顯著。所以, 可以得出由東海原甲藻制備的兔血清中多克隆抗體的效價是23 000。圖3中結(jié)果顯示, A、B、C、D四只小鼠在單克隆抗體稀釋倍數(shù)低于16 000時, 吸光度值大于1.0, 可以得出小鼠血清中單克隆抗體的效價是16 000。

圖2 東海原甲藻多克隆抗體效價Fig.2 Polyclonal antibody titers of P.donghaiense

圖3 東海原甲藻單克隆抗體效價Fig.3 Monoclonal antibody titer of P.donghaiense

2.2 ELISA試驗條件的選擇

酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)為5 000倍時, 檢測得到的吸光度值為0.998, 最接近 1.0, 確定酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度為1∶5 000(表1)。當(dāng)單抗?jié)舛葹?∶4 000, 多抗?jié)舛葹?∶2 000, 檢測得到的吸光度值為0.996, 最接近于1.0, 同時陰性檢測數(shù)值小于 0.1, 確定單抗和多抗的最佳工作濃度分別為1∶4 000和1∶2 000(表2)。

表1 不同濃度酶標(biāo)二抗A450值Tab.1 The absorbance of secondary antibody labeled with different percentage of enzyme

表2 棋盤法比色結(jié)果Tab.2 Results of checkerboard method

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行雙抗體 ELISA檢測, 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0521x+0.0536,R2=0.999, 大于0.995(圖4)。濃度稀釋到 1×103個/mL時, 檢測得到的吸光度值已經(jīng)小于0.1, 和標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為0時的數(shù)值很接近, 所以此方法的最低檢出限為1×103個/mL。

圖4 雙抗體ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of double antibodies sandwich ELISA

2.4 模擬樣品檢測

試驗證明, 本研究建立的雙抗體 ELISA檢測方法對單一藻種樣品的檢測結(jié)果與鏡檢得到的“真實”濃度基本一致, 相對誤差小于 30%(平均值在(1±30%)μ范圍內(nèi),μ為平均值)。經(jīng)過t檢驗, sig 值小于 0.05, 沒有顯著性差異, 結(jié)果如表3, 達(dá)到了定量檢測準(zhǔn)確度的指標(biāo)要求。并且該方法在對混合藻種樣品的檢測中表現(xiàn)出良好的特異性(表4), 不會受其他藻種的影響, 表明該方法可以實現(xiàn)對東海原甲藻的快速定性、定量檢測。

表3 單一藻種樣品檢測結(jié)果Tab.3 The test results of pure strains

表4 在其他混合藻液中加入東海原甲藻的檢測結(jié)果Tab.4 The test results of P.donghaiense in other microalgae solutions

2.5 現(xiàn)場試驗結(jié)果

由于赤潮監(jiān)控海區(qū)數(shù)據(jù)變化范圍較大, 對抗體定量法計算和顯微鏡直接計數(shù)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)處理后, 以顯微鏡觀測數(shù)值為x軸, 抗體定量檢測計數(shù)為y軸, 得到以下曲線(圖5、圖6)顯微鏡計數(shù)和抗體定量法檢測得到藻細(xì)胞濃度數(shù)據(jù)具有高度的一致性, 相關(guān)系數(shù)分別為 0.998和 0.992, 具有良好的正相關(guān)關(guān)系。證明本實驗建立的酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)可以和顯微鏡計數(shù)一樣, 較準(zhǔn)確地檢測樣品中東海原甲藻的細(xì)胞濃度。

圖5 赤潮監(jiān)控海區(qū)東海原甲藻顯微鏡計數(shù)和抗體檢測計數(shù)結(jié)果Fig.5 Microscope counting and antibody detection counting results of P.donghaiense in Red Tide Monitoring Sea

圖6 嵊泗海水浴場東海原甲藻顯微鏡計數(shù)和抗體檢測計數(shù)結(jié)果Fig.6 Microscope counting and antibody detection counting results of P.donghaiense in ShengSi Beach

利用雙抗體ELISA對2013年5月至9月赤潮監(jiān)控海區(qū)東海原甲藻的密度進(jìn)行檢測(圖7)。由圖可以看出顯微鏡檢測計數(shù)和抗體定量檢測計數(shù)得到的曲線基本一致。東海原甲藻暴發(fā)時間是5月底至6月初, 最高濃度為 1.1×104個/mL。7月底至 9月也會有一定增長, 最高濃度約為1×102個/mL, 但未達(dá)到赤潮暴發(fā)的程度(約為5×103個/mL)。

圖7 赤潮監(jiān)控海區(qū)2013年5月-9月東海原甲藻濃度變化曲線Fig.7 The concentration curve of P.donghaiense in Red Tide Monitoring Sea from May to September, 2013.

同樣利用該方法檢測嵊泗海水浴場7月至9月東海原甲藻細(xì)胞密度(圖8~圖10)。在 7月下旬、8月初、8月中旬和9月中旬東海原甲藻都保持了較高的細(xì)胞密度, 8月最高(約為40 個/mL), 遠(yuǎn)小于赤潮監(jiān)控海區(qū)的細(xì)胞濃度, 并且暴發(fā)時間相對較晚。分析其原因可能在于: ①海水溫度的影響, 近海地區(qū)溫差變化大。②受潮汐作用的影響, 可將外海的浮游植物帶到近海, 導(dǎo)致近海地區(qū)藻細(xì)胞濃度增加, 且時間延后。

圖8 嵊泗海水浴場2013年7月東海原甲藻濃度變化曲線Fig.8 The concentration curve of P.donghaiense in Shengsi beach in July 2013

圖9 嵊泗海水浴場2013年8月東海原甲藻濃度變化曲線Fig.9 The concentration curve of P.donghaiense in Shengsi beach in August 2013

圖10 嵊泗海水浴場2013年9月東海原甲藻濃度變化曲線Fig.10 The concentration curve of P.donghaiense in Shengsi beach in September 2013

3 討論

近年來, 赤潮的頻繁出現(xiàn)[15]對經(jīng)濟及海洋生態(tài)系統(tǒng)造成了重大影響, 因此建立赤潮早期預(yù)報系統(tǒng)就顯得尤為重要。目前, 除了抗體定量檢測赤潮藻外,還有PCR技術(shù)和rRNA探針技術(shù)[16]。PCR技術(shù)需要高質(zhì)量純化的 DNA, 目前試驗存在 DNA純化效率低及效率不穩(wěn)定的缺點, 在很大程度上影響了分析的準(zhǔn)確性。Lin等[17]發(fā)現(xiàn), 相對于PCR檢測技術(shù), 免疫學(xué)檢測方法的靈敏性略低, 但對較高細(xì)胞密度的檢測結(jié)果更為穩(wěn)定, 不會受到樣品中其他藻類和懸浮物質(zhì)的影響, 可以實現(xiàn)小樣本大批量的樣品檢測。Anderson 等[18]通過對比試驗發(fā)現(xiàn), 相對于 rRNA探針技術(shù), 抗體檢測方法操作要求低, 結(jié)果穩(wěn)定性高,不易受外界條件影響。因此, 在免疫學(xué)基礎(chǔ)上建立的針對東海原甲藻的雙抗體 ELISA檢測方法, 在理論和技術(shù)上都是可行的, 具有較大的發(fā)展?jié)摿? 為赤潮檢測和研究提供了新的技術(shù)方法。

免疫學(xué)方法的優(yōu)勢在于不需要對自然海水樣品進(jìn)行過多預(yù)處理就可以進(jìn)行測定; 單抗的制備步驟相對簡單、成本也較低廉; 單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展使制備高特異性、高度均一的抗體成為可能; 封閉抗體技術(shù)則使多克隆抗體的應(yīng)用價值得到極大提高[19]。利用抗體免疫檢測方法對海藻細(xì)胞進(jìn)行定性定量檢測的一個障礙就是需要特異性的抗體。本實驗成功制備了特異性的單克隆抗體和多克隆抗體。實驗過程中, 免疫動物沒有發(fā)生意外死亡情況, 在第四次免疫之后產(chǎn)生的抗體就表現(xiàn)出很高的親和力。本研究建立的雙抗體ELISA檢測方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999, 線性關(guān)系良好, 檢測限為1×103個/mL。模擬樣品和現(xiàn)場實驗表明, 該方法可以對東海原甲藻進(jìn)行定性、定量檢測并且不會受到海水中其他海藻和懸浮顆粒物的影響, 檢測結(jié)果與鏡檢結(jié)果相吻合, 檢測過程只需要幾個小時。

本研究建立的針對東海原甲藻的雙抗體 ELISA檢測方法可以實現(xiàn)對該藻的快速定量檢測, 但是海洋中的海藻種類繁多, 目前的特異性驗證對象只是針對常見藻種, 對于一些其他藻種的影響還有待進(jìn)一步驗證; 靈敏度不是很高, 方法還需要進(jìn)一步完善。本實驗室 Xin等[20]、亓海剛等[11]分別用競爭型ELISA方法和間接 ELISA方法實現(xiàn)了對裸甲藻(Gymnodiniumsp.)和赤潮異彎藻(H.akashiwo)的定量檢測; Fabienne等[21]利用特異性單克隆抗體, 建立了微小亞歷山大藻(Alexandrium minutum)全細(xì)胞快速檢測的 ELISA方法。與其相比, 本研究建立的雙抗體ELISA方法具有特異性好、不易受外界因素干擾、穩(wěn)定性好的優(yōu)點, 在一定程度上反應(yīng)赤潮暴發(fā)的情況, 對中國近海赤潮暴發(fā)的實時監(jiān)控具有重要意義。特別是可以據(jù)此研制出標(biāo)準(zhǔn)化的ELISA檢測試劑盒, 可使東海原甲藻的檢測更為簡便。

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