中國鱟基因組微衛星富集文庫的構建及分析

寧曄鳳 , 黎中寶 , 戴 剛 , 上官靜波 , 李清薈

(1.集美大學 水產學院, 福建 廈門 361021; 2.福建省海洋漁業資源與生態環境重點實驗室, 福建 廈門361021)

中國鱟(Tachypleus tridentatus)又名三刺鱟、小海鱟或東方鱟, 是大型海洋底棲動物, 其祖先可追溯至4億多年前, 是動物界少數現存珍貴的“活化石”[1]。它隸屬于節肢動物門(Arthropoda)、肢口綱(Merostomata)、劍尾目(Xiphosura)、鱟科(Limulidae)、鱟屬(Tachypleus), 主要分布于中國長江口以南、日本九州島以南、爪哇島以北海域[2]。中國鱟具有極高的經濟、藥用及科學研究價值, 其血液制品鱟試劑是目前檢測內毒素應用最廣、最有效的試劑[3], 且其微妙的視神經系統使得它成為生理學和仿生學研究的重要模型[4]。然而近些年來, 棲息地生境的破壞、人類大規模濫捕濫殺等原因造成了中國鱟數量銳減, 野生資源幾近枯竭[5], 加之其生長周期從卵細胞受精至成熟需要 13~15年, 中國鱟的保育工作迫在眉捷[6]。目前,福建、浙江、廣東、海南及廣西省已將中國鱟列為省級重點保護動物, 因此, 進行中國鱟資源保護及開展相關基礎研究顯得十分需要。

微衛星即為簡單重復序列(simple sequence repeat, SSR)又稱為短串聯重復序列(Short Tandem Repeat, STR), 是由中央核心序列和兩側保守側翼序列組成的, 核心序列為少數幾個核苷酸(2~6個)組成的串聯重復核苷酸序列。由于微衛星分子遺傳標記技術所具有的易分離、共顯性、多態性高、信息含量多、關聯性好等優點[7], 使得其在物種遺傳多樣性分析研究上比其他DNA標記技術更適合, 并因此在瀕危動物種群遺傳學及保護遺傳學中得到越來越多的應用[8-9]。中國鱟作為重要的野生保護動物之一, 目前國內對中國鱟的研究多見于資源分布及保育方面[10-11],中國鱟微衛星標記分離方面的研究還有很大空缺,目前相關研究僅見于Li等[12]開發出7對多態微衛星引物。

本研究采用生物素標記的(GT)15、(CT)15混合探針雜交與磁珠富集法相結合從中國鱟基因組中構建微衛星富集文庫, 通過克隆、測序、設計引物和PCR檢測來獲得多態性微衛星標記, 為進一步研究中國鱟群體遺傳多樣性, 種群遺傳結構的分析奠定基礎,且為其野生種質資源保護及評估提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中國鱟樣品采自福建省廈門市集美水產品市場,平均體長為35.6 cm。剪取樣品附肢肌肉于95%乙醇中固定, 并于–20℃保存。

1.2 基因組 DNA 的提取與檢測

基因組 DNA采用試劑盒提取法。具體操作步驟按照天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒-離心柱型/DP304(天根生化科技有限公司, 北京)的說明書進行。經K5500超微紫外分光光度計測定所提基因組 DNA 的純度和濃度后, 取 2 μL 基因組DNA 進行 1%瓊脂糖凝膠小樣量樣品電泳檢測其DNA完整性, –20℃保存備用。

1.3 酶切及接頭連接

基因組DNA選用FastDigest Tru1I酶(Fermentas)進行快速酶切, 并選取400 bp~1 000 bp片段進行連接。等摩爾比混合兩組寡核苷酸鏈 LinkerA(5'-GACGATGAGTCCTGAG-3')及LinkerB (5'-TACTCA GGACTCAT-3'), 95℃變性10 min, 37℃10 min, 冰置10 min, 形成終濃度為 10 μmol/L 的雙鏈接頭供連接體系使用。

建立30 μL的連接體系, 其中包括酶切產物20 μL,雙鏈接頭 5μL (10μmol/L), T4 連接酶(5 U/μL)1 μL,10×T4 buffer 4 μL, 于 22℃連接過夜。

1.4 微衛星文庫的構建

1.4.1 雜交

將10 μL接頭連接產物于95℃變性 10 min, 迅速置于冰上使雙鏈分開。取變性后的連接產物與生物素標記的 Bio-(CT)15、Bio-(GT)15混合探針進行雜交反應, 反應體系為 50 μL , 其中包括 25 μL 已預熱至55℃的緩沖液2×Hyb buffer, 10 μL 接頭連接產物, 5μL Bio-(CT)15(10μmol/L), 5 μL Bio-(GT)15(10 μmol/L) 以及 5 μL ddH2O。61℃雜交 1 h, 放置 4℃備用。

1.4.2 磁珠富集純化

1.4.2.1 平衡磁珠

取150 μL混勻后的磁珠(Promega, USA)原液于1.5 mL離心管。而后置于磁力架上吸附磁珠, 輕輕吸出上清鹽保護液。用150 μL(等比例)0.5×SSC于室溫下洗滌磁珠兩遍, 最后加入150 μL 1×Hyb buffer重懸磁珠。

1.4.2.2 磁珠的富集

于已平衡好的重懸磁珠液中加入 50 μL雜交產物混勻, 室溫下放置30 min, 期間每5 min用移液槍輕輕吹打混勻 1 次, 30 min 后將離心管置于磁力架上,吸去上清液。之后將離心管放置于磁力架上于室溫下依次用 400 μL 洗脫液 I(2×SSC, 0.1% SDS)和400 μL 洗脫液Ⅱ(1×SSC, 0.1% SDS)各洗脫2次。最后再用已提前預熱至 50℃的 洗脫液Ⅱ(1×SSC, 0.1%SDS)400 μL快速洗脫兩次。即可基本將不含微衛星的以及與探針結合不牢固的片段去除干凈。

1.4.2.3 捕獲微衛星片段

洗脫完成后, 在洗脫液中加入200 μL TE混合均勻, 95℃溫育 10 min后, 將釋放出含有單鏈微衛星序列的片段, 迅速將其置于磁力架上吸取上清液轉至新離心管中。

1.4.2.4 純化富集微衛星片段

在上述制備好的含有微衛星片段的溶液中加入400 μL, –20 ℃ 預冷的無水乙醇, 并加入 22 μL NaAc/EDTA(pH8.0)螯合劑助沉, 冰置15 min后4℃, 12 000 r/min 離心 10 min, 棄上清。再加入 500 μL, –20℃預冷的 75%乙醇, 冰置 15 min后4℃, 12 000 r/min離心10 min, 棄上清, 室溫風干樣品。最后用25 μL TE溶液溶解微衛星DNA, 放置4℃過1~2 d待微衛星 DNA 充分溶解后方可使用。

1.5 產物擴增及純化

建立 25 μL 擴增體系, 用 MseI primer(MseI adapterA)為引物對富集純化所得微衛星 DNA 片段進行 PCR 擴增。擴增體系包括精制產物2 μL, 10×Taq Buffer(含 Mg2+) 4 μL, dNTPs(10mmol/L)0.4 μL, Taq聚合酶(5U/μL)0.2 μL, MseI primer 引物 1.4 μL(10 μmol/L), 17 μL ddH2O。PCR 擴增條件為: 95℃預變性 2 min, 32×(95℃ 30 s, 53℃ 30 s, 72℃ 40 s),最后 72℃, 20 min 完成擴增片段末端加poly A。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物片段。選取片段400 bp~1 000 bp的產物, 用 GenCleanPCR回收試劑盒(上海捷瑞)純化, 去除多余的dNTPs 和接頭等雜質。

1.6 載體連接、富集文庫的篩選及測序

取2 μL純化產物與pMD19-T載體(Takara, Japan)于16℃連接3.5 h, 將連接產物轉化至感受態大腸桿菌 DH5α中培養, 得到中國鱟微衛星基因組文庫。挑選陽性單克隆菌接種于含有氨芐青霉素的 LB液體培養基中, 37℃振蕩培養 3.5 h。隨后用 M13F/R通用引物進行 PCR 擴增篩選檢測, 用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物, 挑取片段為400 bp~1 000 bp的陽性克隆菌液送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

1.7 序列分析與引物設計

利用 NCBI載體查找工具 VecScreen 去除兩側的載體引物, 匯總所有輸出序列后再利用微衛星查找軟件SSRHunter 1.3 對重復序列進行查找。獲得的微衛星序列按完美型, 非完美型和復合型人工細化分析。并用 Primer Premier version 5.0對所得的微衛星序列進行引物設計。

2 結果與分析

2.1 克隆與測序結果

經PCR檢測篩選, 本研究共獲得334個陽性克隆,從中隨機選取196個片段大小為400 bp~1 000 bp的陽性克隆送出測序。圖1為部分篩選結果的電泳圖。

圖1 單克隆檢測結果Fig.1 Partial results of the positive monoclonal PCR detection

2.2 微衛星重復次數分析

在送出的 196個陽性克隆的測序過程中, 有 18條微衛星序列測序出現中斷, 測序失敗, 占所有克隆的9.08%。這部分的測序結果顯示, 在單個克隆中有多處微衛星重復序列, 有的甚至高達 6 處, 并且重復次數通常大于30次, 復雜的堿基重復可能是導致測序過程出現信號衰減、測序峰圖紊亂、測序中斷的原因。圖2為單向測序測通的中國鱟基因組中微衛星的特征序列部分峰圖。

圖2 中國鱟基因組中微衛星特征序列(CAAA)nFig.2 Diagram of (CAAA)n repeat sequence in Tachypleus tridentatus

本研究利用磁珠富集獲得的中國鱟基因組微衛星最大重復次數為 98次, 大多集中在 7~35次, 占82.6%; 最高在5~10次, 為29.5%, 多數是二核苷酸堿基重復7次以上的微衛星序列; 50次以上的頻率為10.2%(圖3)。

圖3 中國鱟微衛星重復次數與分布頻率Fig.3 Distribution frequency of microsatellite repeat times in Tachypleus tridentatus

2.3 微衛星序列結果及分類

利用SSR hunter 1.3軟件對去除載體引物后的序列進行微衛星序列的查找, 使用的標準依據Linda[13]對微衛星的劃定標準: 單堿基重復大于 14次, 雙堿基重復大于7次, 三堿基重復大于5次, 四堿基及五堿基重復大于4次。結果顯示, 在178個成功測序的陽性克隆中共獲得 127個微衛星序列, 其中完美型占 69.3%; 非完美型占 11.0%; 復合型 占 19.7%(表1)。除探針使用的GT和CT的重復序列外, 還篩選到多堿基 GCT、TGG、AAAC、ACAA、GATTT、TTTTA 的重復序列。部分微衛星詳細信息可見表2。

表1 中國鱟基因組微衛星序列分類情況Tab.1 Systematization of microsatellites in T.tridentatus

表2 部分微衛星位點引物及其他相關信息Tab.2 Relevant information of part of microsatellite primer sequences of T.tridentatus

2.4 引物設計及擴增結果分析

利用引物設計軟件 Primer Premier version 5.0對所得到的序列設計引物, 在 127個微衛星序列中,有43個微衛星座位由于位于序列的末端或沒有足夠的側翼序列無法設計, 在有側翼的 84個序列中, 然后為選定的序列設計 PCR引物, 在 moderate stringency條件下[溫度: 45.0~70.0℃, GC含量: 40%~60%; 引物長度: (21±4) bp; PCR產物大小: 100~330 bp], 有56個序列可設計出引物, 本研究選擇合成40對, 其中有19對可擴增出清晰目的條帶, 16對表現出單一條帶, 3對表現出多態性。圖4為TF-4位點擴增圖譜。目的片段為237bp處, 顯示出多態性。

圖4 中國鱟TF-4位點擴增圖譜Fig.4 Electrophoretogram of TF-4 locus in T.tridentatus

3 討論與結論

3.1 酶切片段的大小及酶的種類

構建微衛星富集文庫文庫時, 使用的酶切片段大小應適宜, 過長的片段易導致親和捕捉不到, 后續難以擴增, 影響測序結果, 增加實驗成本; 過短的片段則很難保證微衛星側翼序列長度, 影響引物的設計, 進而影響多態性引物的篩選。從便于提高實驗有效性角度來看, 本實驗選用400~1 000 bp大小的酶切片段是合理的。在選擇限制性內切酶上, 本實驗選用FastDigest Tru1I酶(Fermentas)是由于其酶切位點在動物基因組中分布廣泛, 可以將基因組DNA均勻地切成大小不同的片段, 且反應速度很快, 大大縮減了實驗用時, 既保證了實驗準確性、微衛星位點隨機性, 又保證了實驗結果的高效性和真實性。

3.2 探針的選擇

在所有動物基因組中(CA)n或(GT)n微衛星的含量最為豐富, 其次是(CT)n[14]。本研究選用(GT)n為探針進行富集和雜交。為了提高微衛星的富集效率,Edwards[15]等提出用多種探針來篩選文庫被廣泛應用。Stamati[16]等利用(CA)15、(GA)8、(AAG)8和(ATG)8為探針構建了Salix lanata基因組文庫, 李齊發等[17]選擇(CA)12、(CCG)8、(CAG)8和(TTTC)8混合探針富集牦牛微衛星, 均證實了應用多種探針混合進行雜交分離微衛星片段是增加微衛星種類的理想選擇。因此本研究在(GT)15的基礎上又采用了(CT)15探針,以期獲得更多的微衛星標記位點。此外, 探針選用時堿基數要適中, 探針堿基對的增加會直接影響到雜交的效率, 堿基對越多越難雜交。所以在以后的研究中, 根據研究對象特點選用相應合適的混合探針,是成功獲得更多微衛星種類的必要條件。

3.3 微衛星序列特征及擴增結果分析

本研究中獲得的微衛星序列中, 完美型微衛星占69.3%、不完美型占11.0%、復合的占19.7% 其中完美型微衛星比例最高, 此結果與日本盤鮑(Paralichthys olivaceus)[18]、細角螺(Hemifusus ternatanus)[19]、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)[20]、劍尾魚(Xiphophorus helleri)[21]、海灣扇貝(Argopecten irradians)[22]以及大珠母貝(Pinctada maxima)[23]等水產動物的微衛星序列特點基本相符。微衛星核心序列相對較高的突變率, 是微衛星多態性的基礎。根據Weber等[24]的觀點, 重復次數高的微衛星在種群中表現出的多態性高。本研究所得序列重復次數多集中在7~35, 占82.6%, 最高達到98次。但是高重復性序列往往周圍側翼序列不足, 或是1個克隆中出現多處微衛星序列, 復雜的堿基重復, 導致測序峰圖紊亂以至于引物設計困難。

本實驗研究顯示, 合成的引物 40對經擴增后,有19對可擴增出清晰目的條帶。其中有16對表現出單一條帶, 3對具有多態性。其余的因存在無擴增產物, 擴增產物與目的條帶長度不一致, 擴增圖譜個體缺失嚴重等導致無法判定。出現這些情況的原因可能是由于某些引物序列特異性不好, 無法擴增出產物, 某些引物與基因組中序列錯配, 導致擴增產物長度改變, 或是有些個體基因突變, 無法與引物結合。本實驗篩選出的微衛星引物可為中國鱟遺傳多樣性分析的進一步研究奠定基礎, 為以后中國鱟的遺傳育種、種苗放流等提供基礎理論依據, 這對于后期實現其種質資源保護及科學的管理具有重要意義。

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