眼針運動療法對腦缺血再灌注大鼠腦缺血半暗帶區VEGF蛋白及VEGFmRNA表達的影響*

邵 妍，王鵬琴，王樹東，李超華

(1．遼寧中醫藥大學，沈陽 110032;2．遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110033)

眼針運動療法對腦缺血再灌注大鼠腦缺血半暗帶區VEGF蛋白及VEGFmRNA表達的影響*

邵 妍1，2，王鵬琴2，王樹東1，李超華1

(1．遼寧中醫藥大學，沈陽 110032;2．遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110033)

目的:觀察眼針運動療法對腦缺血再灌注(MCAO)模型大鼠大腦缺血半暗帶區域腦組織內VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達的影響。方法:采用隨機數字表法將SD大鼠按隨機數字表法分為空白對照組、假手術組、模型復制組。對模型復制組大鼠采用線栓法進行腦缺血再灌注模型復制，再將模型復制組按隨機數字表法分為模型對照組、眼針組、眼針加運動組，分別進行眼針、眼針運動療法干預治療，采用RT-PCR及western-blot法對各組大鼠腦組織中VEGF、VEGFR1/2基因及蛋白表達水平進行檢測。結果:與空白對照組比較，模型對照組、眼針組及眼針運動療法組大鼠腦缺血半暗帶區域組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白表達水平顯著升高;與模型對照組比較，眼針組及眼針運動療法組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白表達水平顯著升高;眼針運動療法組大鼠腦組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白表達水平高于眼針組。結論:眼針運動療法能夠促進腦缺血再灌注損傷后腦內缺血半暗帶區域內VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白的表達，從而促進半暗帶組織中血管的新生，加快側枝循環的建立，實現其腦保護作用。

眼針療法;眼針運動療法;腦缺血再灌注;血管內皮生長因子;側枝循環

腦卒中是嚴重威脅人類健康的疾病，占腦血管病發病率80%左右，其病死率、復發率、致殘率在我國死亡率中僅次于惡性腫瘤，嚴重危害人類健康［1-2］。眼針運動療法是我的導師王鵬琴教授在眼針療法基礎上結合多年臨床經驗創建，即中風患者在眼針針刺同時進行康復訓練。目前，眼針運動療法治療腦卒中在我院康復中心應用已3年余，治療腦卒中患者500多名，該方法能明顯改善中風后遺癥患者的臨床癥狀且療效顯著，明顯提高其生活質量。近年來，眼針在治療缺血性腦血管病方面收到了一定的療效，但其機理尚不明確［3］，而關于眼針運動療法的實驗研究國內尚未有相關報道。

本研究以眼針運動療法為干預因素，對腦缺血再灌注模型大鼠進行治療，以觀察VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達水平的變化，為眼針運動療法治療缺血性腦卒中提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

健康SPF級SD大鼠70只，雌雄不限，體質量(280±20)g，由遼寧長生生物技術有限公司提供(許可證號SCXK(遼)2010-0001)。自由飲水，標準顆粒飼料喂養，室內溫度18～22℃，相對濕度45%。

總 RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒、DNA marker購自寶生物工程(大連)有限公司，VEGF及VEGFR1/2引物由北京三博遠志生物科技有限公司代為合成。親和純化兔抗大鼠VEGF及VEGFR1/2多克隆抗體購自 abcam公司，羊抗兔二抗、蛋白marker購自北京全式金生物技術有限公司。

1．2 實驗方法

①實驗分組采用隨機數字法將70只SD大鼠隨機分為空白對照組(10只)、假手術組(10只)、模型復制組(50只)3組。對模型復制組大鼠采用線栓法進行腦缺血再灌注模型復制，再將模型復制成功的40只大鼠(模型復制50只，失敗9只，模型評價1只)按隨機數字表法分為2組，分別為模型對照組(14只)、眼針組(13只)、眼針運動療法組(13只);②模型制備與評價參照馬賢德等人的研究方法［4］，對模型復制組50只大鼠采用改良線栓法復制大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。模型的評價參照ZeaLonga 5分制評分標準［2］:0分:無癥狀;1分:不能完全伸展對側前爪;2分:向對側轉圈;3分:向對側傾倒;4分:不能自發行走，意識喪失。評分1～3分者納入實驗組，未達標準者排除;③ 眼針取穴及針刺手法:取13 mm毫針，眼針組于大鼠眶周2 mm處針刺，定位參照人體取穴方法［3-4］，取肝區、上焦區、下焦區、腎區(見圖1)。針刺手法:從眼眶邊緣1 mm部位平刺，左眼按照順時針方向(右側按逆時針方向)，從該穴區起始定位線向終止定位線進針，進行平刺操作，刺入真皮達到皮下組織，進針3 mm，到終止定位線為止。留針20 min，留針10 min時用刮柄進行刮針1次，刮針5下。治療時機:眼針組于腦缺血再灌注后1 h即開始針刺，每隔8 h進行1次，缺血72 h后進行樣本采集，采集樣本前30 min進行末次針刺，共計9次針刺干預。空白對照組、假手術組和模型對照組不做針刺干預;④ 眼針運動療法:眼針運動療法組大鼠在眼針治療同時在跑步機上進行訓練，時間為30 min，跑步機速度為5 m/min，坡度為0度，每日2次;⑤ 指標測定模型復制后2 h，根據ZeaLonga 5分制評分標準對各組大鼠進行行為學體征評分并分析。模型復制2 h后，于空白對照組、假手術組和模型復制組大鼠中各隨機抽取1只，斷髓處死后取出整個腦組織，采用TTC染色方法觀察腦缺血壞死灶發生情況。各組大鼠腦缺血半暗帶區域組織VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(Western blot法):末次針刺后10 min，各組大鼠隨機抽取8只，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，斷頭取出整個腦組織去掉小腦，觀察大腦軟化灶范圍，用手術刀柄鈍性剝離去除液化的腦組織，沿梗死灶邊緣切取1 mm寬的半暗帶腦組織(空白對照組和假手術組切取顳葉大腦皮層組織)，按組織凈重與裂解液1∶10的比例加入蛋白提取試劑，并用玻璃勻漿器在冰上進行勻漿，勻漿后靜置于冰上20 min，10000 r/min進行離心，離心15 min分離上清液即為總蛋白備用。采用考馬斯亮藍法對各組總蛋白進行蛋白定量，每孔上樣20 ug總蛋白進行電泳，半干轉印法將蛋白轉至PVDF膜，一抗(1∶200) 4℃孵育過夜，二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，ECL發光，膠片曝光，掃描膠片，并于凝膠成像分析系統中測定目的蛋白條帶和內參蛋白條帶灰度值，以目的條帶灰度值/內參條帶灰度值作為該例樣本的蛋白表達水平進行統計分析。各組大鼠腦缺血半暗帶區域組織VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達(RTPCR法):采用RT-PCR方法對各組大鼠腦缺血半暗帶組織VEGF、VEGFR1/2 mRNA表達水平進行檢測。

VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA引物序列如下:擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像分析系統采集圖像并測定目的基因及內參基因條帶的積分光密度值，以目的基因積分光密度值/內參基因積分光密度值比值作為統計數據進行統計分析。

表1 引物序列表

1．3 統計學方法

采用SPSS 10．0軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 模型評價結果

與空白對照組比較，模型復制組大鼠行為學評分有統計學意義(P＜0．01);與假手術組比較，模型復制組大鼠行為學評分有統計學意義(P＜0．01)。

表1圖1顯示，全腦組織TTC染色結果顯示，模型復制組大鼠出現明顯梗死灶，而空白對照組和假手術組未見梗死灶出現。

2．2 各組大鼠腦缺血半暗帶區域組織VEGF、VEGFR1/2蛋白表達結果

表2、圖2～4顯示，VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達結果顯示，與空白對照組比較，模型對照組、眼針組及眼針加運動組大鼠腦缺血半暗帶區域組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達水平顯著升高(P＜0．01)，差異有統計學意義;與模型對照組比較，眼針組及眼針加運動組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達水平顯著升高(P＜0．05或0．01)，差異有統計學意義;眼針加運動組大鼠腦組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達水平高于眼針組(P＜0．05)

表2 各組大鼠行為學評分(±s)

表2 各組大鼠行為學評分(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0．01;與假手術組比較:#P＜0．01

組 別 例數 行為學評分空白對照組10 0．000±0．000假 手 術 組 10 0．100±0．316模型復制組 41 2．244±0．624*#

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色

表3 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達水平(±s)

表3 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達水平(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0．01;與模型對照組比較:#P＜0．05，##P＜0．01;與眼針組比較:△P＜0．05

組蛋白表達水平(灰度值比值) VEGF VEGFR1 VEGFR2空白對照組別例數6 0．191±0．016 0．209±0．014 0．257±0．020假 手 術 組 6 0．180±0．021 0．217±0．014 0．252±0．018模型 對 照 組 6 0．308±0．026* 0．348±0．022* 0．377±0．024*眼 針 組 6 0．336±0．014*# 0．370±0．020*# 0．412±0．020*##眼針加運動組 6 0．365±0．018*##△0．391±0．014*##△ 0．438±0．022*##△

圖2 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF蛋白表達注:1．空白對照組;2．假手術組;3．模型對照組; 4．眼針組;5．眼針加運動組

圖3 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGFR1蛋白表達注:1．空白對照組;2．假手術組;3．模型對照組; 4．眼針組;5．眼針加運動組

2．4 各組大鼠腦缺血半暗帶區域組織VEGF、VEGFR1/2 mRNA表達結果

表3、圖5～7顯示，VEGF、VEGFR1、VEGFR2mRNA表達結果顯示，與空白對照組比較，模型對照組、眼針組及眼針加運動組大鼠腦缺血半暗帶區域組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達水平顯著升高(P＜0．01)，有統計學意義;與模型對照組比較，眼針組及眼針加運動組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達水平顯著升高(P＜0．01)，有統計學意義;眼針加運動組大鼠腦組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達水平高于眼針組(P＜0．05)。

圖4 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGFR2蛋白表達注:1．空白對照組;2．假手術組;3．模型對照組; 4．眼針組;5．眼針加運動組

表4 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達水平(±s)

表4 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表達水平(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0．01;與模型對照組比較:#P＜0．01;與眼針組比較:△P＜0．05

組 別 例數蛋白表達水平(積分光密度比值) VEGF mRNA VEGFR1 mRNA VEGFR2 mRNA空白 對照 組6 0．195±0．029 0．220±0．030 0．250±0．029假 手 術 組 6 0．192±0．033 0．228±0．026 0．252±0．025模型 對 照 組 6 0．321±0．029* 0．358±0．038* 0．425±0．055*眼 針 組 6 0．401±0．027*# 0．459±0．050*# 0．509±0．066*#眼針加運動組 6 0．442±0．033*#△ 0．515±0．056*#△ 0．567±0．053*#△

圖5 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGF mRNA表達注:M．marker;1．空白對照組;2．假手術組; 3．模型對照組;4．眼針組;5．眼針加運動組

圖6 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGFR1 mRNA表達注:M．marker;1．空白對照組;2．假手術組;3．模型對照組; 4．眼針組;5．眼針加運動組

3 討論

眼針療法［5-6］是彭靜山教授根據中醫理論和臨床探索創立的，經過40余年的臨床應用及不斷發展，具有完備的系統理論的一種特色微針療法。《靈樞·邪氣臟腑病形》:“十二經脈，三百六十五絡，其血氣皆上于面而走空竅，其精陽氣上走于目而為晴。”王肯堂《證治準繩》所載華佗論述:“目形類丸，瞳神居中而前，如日月之麗東南而晚西北也……故凡病發，則有形色絲絡顯現，而可驗內之臟腑受病也”，均為眼針的理論根據。我的導師課題組既往通過國家科技部973課題研究，創新提出“眼針八區十三穴絡腦通臟腑”的眼針核心理論。

康復訓練對于腦卒中患者的治療效果還不理想，因此探索一個適合我國國情的康復治療體系，探尋康復治療腦卒中的有效方法是非常必要和急迫的［7］。近年來研究表明，針刺和康復訓練［8-9］能夠改善腦卒中后認知障礙，提高運動功能和日常生活活動能力。

腦血管側支循環分三級:1級側支循環是前交通動脈(AComA)和后交通動脈(PComA);2級側支循環是眼動脈和軟腦膜側支;3級側支循環是新生血管，是目前研究熱點。如何有效地打開二級側支循環，促進三級側支代償即新生血管的發生，良好的側支循環可減少梗死灶容積，改善預后，減低復發風險，是目前臨床治療的研究方向［10-11］。眼針運動療法治療腦卒中臨床療效顯著，其治療機制可能是通過上調MCAO模型大鼠腦組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白的表達水平，促進半暗帶組織中血管的新生，加快側支循環的建立，實現腦保護作用。

血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)是由Ferrara等于1989年在牛垂體濾泡星狀膠質細胞體外培養液中純化而來，能夠參與血管新生，在目前發現的調節因子中，VEGF內皮細胞特異性最高，促血管構建作用最強［12］。正常機體中，VEGF表達水平較低，而在病理條件下，VEGF無論是基因水平還是蛋白水平，均表現為過表達［13］。也有研究表明［14-15］，VEGF基因啟動子區包含HIF-1的反應元件，缺血缺氧刺激可強效誘發VEGF及其受體的表達，也有人認為缺氧因素可激活 c-Src，而 c-Src能偶上調 VEGF的表達［16］。VEGF能夠增加血管的通透性，促進血管外基質沉淀，從而促進血管新生［17］。

本研究在模型復制后，分別應用眼針療法和眼針運動療法治療，各組大鼠腦組織檢測結果顯示，腦缺血再灌注發生后，腦組織缺血半暗帶區域內VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA及蛋白表達水平顯著升高。眼針和眼針運動療法組治療后，三者表達水平進一步上調，眼針運動組大鼠表達上調尤為明顯。

綜上所述，眼針療法及眼針運動療法可以增加腦缺血再灌注損傷引起腦內缺血半暗帶血管內皮生長因子及其受體表達增高，從而促進半暗帶組織中血管的新生，通過缺血半暗帶區域腦組織VEGF/ VEGFR信號傳導通路，促進微血管的新生，從而加速側枝循環建立，改善腦部缺血，從而發揮對腦細胞損傷的保護作用 為臨床進一步應用眼針運動療法治療缺血性腦血管疾病奠定理論基礎。

圖7 各組大鼠腦缺血半暗帶組織中VEGFR2 mRNA表達注:M．marker;1．空白對照組;2．假手術組;3．模型對照組; 4．眼針組;5．眼針加運動組

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Eye acupuncture with exercise to concentrate on cerebral ischemia and ischemia rats half dark stripe effect of VEGF protein expression and VEGFmRNA

SHAO Yan1，2，WANG Peng-qin2，WANG Shu-dong1，LI Chao-hua1

(1．Liaoning，Liaoning university of Traditional Chinese medicine，Shenyang 110032，China; 2．Liaoning university Hospital of Traditional Chinese medicine，Shenyang 110033，China)

Objective:to observe the needle eye exercise therapy on cerebral ischemia reperfusion(MCAO)model in the rat brain ischemia half dark area within the brain tissue VEGF，VEGFR1，VEGFR2 expression．Methods:using random number method，the SD rats were randomly divided into blank control group，control group，the model copy group．Copy the model group rats by using line switch on cerebral ischemia reperfusion model replication，and then copy model group were randomly divided into model control group，the eye，eye needle plus exercise group．Respectively，eye for eye needle exercise therapy intervention treatment，by the method of Rt-pcr and western blot-of VEGF，groups of rats had VEGFR1/2 for testing the level of gene and protein expression．Results:compared with blank control group，model control group and eye，eye needle group exercise therapy in ischemia rats half dark with VEGF in regional organizations，VEGFR1，VEGFR2 mRNA and protein expression level increased significantly;Compared with model control group，group and eye eye needle exercise therapy group of VEGF in ischemia rats half dark band organization，VEGFR1，VEGFR2 mRNA and protein expression level increased significantly;Needle eye exercise therapy in VEGF group rats had，VEGFR1，VEGFR2 mRNA and protein expression level is higher than eye needle group．Conclusion:pay close attention to again needle eye exercise therapy can promote brain ischemia injury after brain ischemia within half dark belt area of VEGF，VEGFR1，VEGFR2 mRNA and protein expression，thus facilitating half dark with tissue，new blood vessels to speed up the establishment of collateral circulation，achieve the cerebral protective effect．

eye acupuncture;eye acupuncture with exercise therapy;Cerebral ischemia reperfusion;Vascular endothelial growth factor;Collateral circulation

R246．82

B

1006-3250(2015)04-0445-04

2015-01-11