逍遙丸對小鼠卵母細胞BMP-6/Smads通路表達的影響*

楊麗蕓，杜惠蘭，白 靜，孫曉換，范麗潔

(河北中醫學院，中西醫結合生殖疾病協同創新中心，石家莊 050091)

逍遙丸對小鼠卵母細胞BMP-6/Smads通路表達的影響*

楊麗蕓，杜惠蘭△，白 靜，孫曉換，范麗潔

(河北中醫學院，中西醫結合生殖疾病協同創新中心，石家莊 050091)

目的:觀察逍遙丸對小鼠卵母細胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4表達的影響。方法: 將200只雌性小鼠按隨機數字表法分為疏肝高、低劑量組、COH組和空白對照組4組各50只。應用免疫組化和real-time PCR方法分別測定卵母細胞中BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA的表達。結果:與空白對照組比較，COH組BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA表達差異無統計學意義，各治療組BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA表達增加，疏肝高劑量組優于低劑量組;疏肝高劑量組BMPR II蛋白和mRNA表達增加。結論:逍遙丸可使BMP-6表達上調，激活其Ⅱ型受體BMPRⅡ形成受體復合物，然后募集Ⅰ型受體ALK-2和ALK-6使其活化，活化的Ⅰ型受體進一步磷酸化細胞內信號Smad1/5/8，然后與Smad4結合，從而啟動信號傳導干預卵泡發育和卵母細胞的質量。

逍遙丸;卵母細胞;BMPR II;ALK-2;ALK-6;Smad1;Smad5;Smad8;Smad4

目前，不孕癥已經成為嚴重影響育齡夫婦家庭和社會和諧的關鍵性因素，其發病率日益提高，而卵子質量是影響妊娠結局的重要因素之一。卵泡發育及卵子質量受卵母細胞分泌因子(Oocyte secreted factors，OSFs)的調控，其在調節卵泡的發育和衰退、影響優勢卵泡的選擇以及閉鎖卵泡的形成方面發揮著重要作用。其中卵母細胞分泌的轉化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員GDF-9與BMP-6通過與Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結合，與Ⅰ型受體共同作用啟動信號傳導［1］，而Smads是TGF-β超家族下游信號傳導分子，在其信號傳導過程中發揮著重要作用。GDF-9和BMP-6及其Smads信號途徑對體內卵泡發生發育、卵丘擴散、卵母細胞的成熟至關重要［2-3］。疏肝法治療不孕癥臨床療效顯著［4］，本課題前期以逍遙丸作為疏肝法的代表方，研究疏肝法對無排卵模型大鼠生殖功能的影響，證實疏肝法可以通過改善腺垂體、卵巢形態，調節下丘腦神經遞質水平以及生殖內分泌激素FSH、LH、E2水平，促進卵泡發育和成熟，并可促進子宮發育、調節子宮內膜環境，以有利于孕卵著床;并發現逍遙丸促進卵泡發育并誘發排卵的機制可能與上調小鼠卵母細胞和體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者卵泡液中生長分化因子-9(GDF-9)的含量有關［5-6］。但對小鼠卵母細胞的研究發現，逍遙丸并未引起GDF-9下游Smads通路的明顯變化。而逍遙丸是否同樣能調控小鼠卵母細胞中BMP-6的表達，并激活其下游受體及蛋白，啟動Smads信號傳導，進而影響卵子的發育及質量值得研究。本研究以觀察逍遙丸對小鼠卵母細胞BMP-6、相關受體BMPRII、ALK-2、ALK-6及下游 Smads通路中Smad1、Smad5、Smad8和Smad4表達的影響，進一步探討逍遙丸在促卵母細胞發育中的機制，豐富和完善中醫生殖理論。

1 材料

1.1 實驗動物

健康雌性清潔級昆明小鼠200只，6～7周齡，體質量28～32 g，購自河北實驗動物中心(動物合格證號1207019)。自由飲水和進食，飼養室溫度保持在(20±1)℃，相對濕度約50%，自動控制光照12 h，黑暗12 h。

1.2 藥物

逍遙丸由河南宛西制藥股份有限公司生產(批號120404);將200、100丸分別溶于125ml蒸餾水中制成混懸液，高劑量生藥0.6 g/ml，低劑量生藥0.3 g/ml，置4℃冰箱中備用。孕馬血清(PMSG)，上海市計劃生育科學研究所產品(批號20120410);人絨毛膜促性腺激素(HCG)，麗珠集團麗珠制藥廠生產(批號120413)。

1.3 主要試劑及儀器

兔抗小鼠BMP-6(批號bs-3671R);BMPR II(批號bs-4237R);ALK-6(批號sc-25455);Smad1(批號bs-1619R);Smad5(批號bs-2973R);Smad8(批號bs-4253R);Smad4(批號bs-0585R)，以上抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司;ALK-2購自Abnova公司(批號PAB3474);RNA提取試劑盒購自美國ABI公司(批號AM1560);M-MLV反轉錄試劑盒購自美國Promega公司(批號M1701);SYBR Green I熒光定量PCR試劑盒購自加拿大Fementas公司(批號K0221)。ND2000型紫外分光光度計，美國Thermo公司;ABI 7300型熒光定量PCR System，美國ABI公司。

2 方法

2.1 模型制備［7］

第11天同時腹腔注射PMSG 10IU/只，48 h后腹腔注射HCG 10IU/只。正常組每日陰道涂片，觀察動情周期。

2.2 動物分組及給藥情況

將200只雌性小鼠按隨機數字表法完全隨機化分為4組，即疏肝高、低劑量組及控制性超排卵(COH)組和空白對照組各50只。于模型制備前10 d開始每日8∶00灌胃給藥。疏肝高、低劑量組分別給予逍遙丸混懸液0.6 g/ml、0.3 g/ml，COH組和空白對照組用蒸餾水灌胃。各組小鼠均1 ml/100 g體質量灌胃，連續10 d。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 卵母細胞提取方法 空白對照組小鼠于陰道涂片見到大量角化上皮細胞的次日、其余各組小鼠于注射HCG 16 h后脫頸椎處死，在超凈工作臺上手術打開實驗小鼠腹腔，分別取出雙側輸卵管，置于裝有PBS的培養皿中，在體視鏡下用1 ml注射器針頭針劃破輸卵管壺腹部，觀察到有絮狀物釋出，此即為卵丘卵母細胞復合體(COCs)，然后用透明質酸酶消化掉顆粒細胞，用PBS反復沖洗，獲得MⅡ期卵母細胞。

2.3.2 免疫組化染色 將35只小鼠所獲取的MⅡ期卵母細胞移到多聚賴氨酸玻片表面，風干后用4%多聚甲醛固定120 min，30%過氧化氫混合純甲醇浸泡30 min，5%牛血清白蛋白20 min。加入1 ∶50稀釋的抗體2 h，按照SABC免疫組化方法分別加入兔抗山羊二抗、SABC各20 min。按照DAB顯色法顯色10 min，脫水后封片。結合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱2方面采用IHS評分。評分方法為［8］:①陽性細胞數百分比(記為a):＜1%=0分，1%～10%=1分，11%～50%=2分，51%～80%=3分，81%～100%=4分;②陽性細胞顯色強度(記為b):0分(陰性)、1分(弱陽性)、2分(陽性)、3分(強陽性);③a與b乘積為IHS評分進行半定量分析:0為(－)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，9～12分為(+++)。

2.3.3 Real-Time RT-PCR檢測BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8 和Smad4mRNA表達 將15只小鼠所分離的卵母細胞置于低溫離心機中，4℃3000 rpm離心10 min，棄上清液，加入300 μL Lysis/Binding Solution裂解細胞，然后加入30 μL miRNA Homogenate Additive，吹打混勻，冰浴 10 min，加入 300 μL Acid-Phenol: Chloroform，漩渦混合30～60 sec，10000 rpm，室溫離心5 min，吸取上清液轉入新的離心管中，加入100%乙醇375 μL顛倒混勻。將上述液體加入離心柱內芯，10000 rpm離心約15 s，使液體濾過離心柱。棄掉下層濾過的液體，向離心柱芯中加入700 μL miRNA Wash Solution 1，10000 rpm離心約15 s，使液體濾過離心柱，棄掉下層濾過的液體，向離心柱芯中加入500 μL Wash Solution 2/3，10000 rpm離心約15 s，使液體濾過離心柱，棄掉下層濾過的液體，此步驟重復1次。離心柱10000 rpm離心2 min，將濾芯轉入新的收集管中，向柱芯中央加入100 μL的Elution Solution，室溫靜置3 min，然后10000 rpm離心3 min，收集RNA溶解液，紫外分光光度計測定RNA的純度。反轉錄于 PCR儀上42℃進行50 min，95℃加熱5 min，滅火反轉錄酶，然后進行40個循環反應:94℃ 30 s，58℃30 s，72℃30 s，于每個循環的第三個步驟收集熒光信號，擴增完畢進入結果分析界面，根據CT數據方法，得到的目的基因表達的相對定量值(RQ值)，用于統計分析各指標mRNA的表達量。

2.4 統計學方法

應用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，若滿足正態性及方差齊性，多組之間比較用方差分析，否則用秩和檢驗，計數資料采用χ2檢驗。

3 結果

3.1 各組小鼠卵母細胞 BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表達比較

免疫組化結果顯示，空白對照組與COH組表現為胞質呈黃色，疏肝低劑量組表現為胞質呈黃色，邊緣較深，呈棕黃色;疏肝高劑量組卵母細胞表現為胞質呈棕黃色。

表1顯示，與空白對照組比較，COH組BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表達IHS評分差異無統計學意義(P＞0.05)，各治療組 BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表達IHS評分均顯著高于空白對照組及COH組(P＜0.05)，其中，疏肝高劑量組蛋白表達評分較疏肝低劑量組升高(P＜0.05)，疏肝高劑量組BMPR II蛋白表達增加(P＜0.05)。

表1 各組小鼠卵母細胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表達比較(±s)

表1 各組小鼠卵母細胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白表達比較(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0.05;與COH組比較:△P＜0.05;與疏肝低劑量組比較:□P＜0.05;與疏肝高劑量組比較:▽P＜0.05

指標/組別 空白對照組 COH組 疏肝低劑量組 疏肝高劑量組BMP-6蛋白 0.67±0.58 1.00±1.00□▽3.67±0.58＊△▽6.67±1.15＊△□BMPR II蛋白 2.00±1.00 1.67±0.58 2.33±0.58▽6.67±1.15＊△□ALK-2蛋白 0.67±0.58 1.33±0.58□▽3.00±1.00＊△▽6.67±1.15＊△□ALK-6蛋白 0.33±0.58 0.67±0.58□▽2.67±0.58＊△▽4.67±1.15＊△□Smad 1蛋白 0.67±0.58 0.67±1.15□▽2.67±0.58＊△▽4.67±1.15＊△□Smad 5蛋白 1.00±1.00 0.33±0.58□▽3.00±1.00＊△▽8.67±0.58＊△□Smad 8蛋白 0.67±0.58 1.00±1.00□▽2.67±0.58＊△▽8.67±0.58＊△□Smad 4蛋白 1.00±1.00 1.67±0.58□▽4.33±1.53＊△▽8.67±0.58＊△□

3.2 各組小鼠卵母細胞 BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和 Smad4 mRNA的表達比較

表2顯示，與空白對照組比較，COH組BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4 mRNA表達差異無統計學意義(P＞0.05)，疏肝高劑量組 BMPR II mRNA表達增加(P＜0.05);各治療組 BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4 mRNA表達較空白對照組及COH組增加(P＜0.05);疏肝高劑量組表達高于疏肝低劑量組(P＜0.05)。

表2 各組小鼠卵母細胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4 mRNA表達比較(±s)

表2 各組小鼠卵母細胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4 mRNA表達比較(±s)

注:與空白對照組比較:*P＜0.05;與COH組比較:△P＜0.05;與疏肝低劑量組比較:□P＜0.05;與疏肝高劑量組比較:▽P＜0.05

指標/分組 空白對照組 COH組 疏肝低劑量組 疏肝高劑量組BMP-6 mRNA 1.125±0.333 1.058±0.176□▽2.090±0.172＊△▽2.544±0.245＊△□BMPRIImRNA 0.922±0.138 0.981±0.085 0.870±0.146▽1.309±0.203﹡△□ALK-2 mRNA 0.884±0.095 0.944±0.049□▽2.107±0.225＊△▽2.577±0.189＊△□ALK-6 mRNA 0.942±0.041 1.015±0.036□▽3.165±0.061＊△▽3.448±0.175＊△□Smad 1 mRNA 1.063±0.055 1.084±0.073□▽2.393±0.160＊△▽2.734±0.270＊△□Smad 5 mRNA 1.116±0.127 1.048±0.115□▽2.120±0.162＊△▽3.329±0.161＊△□Smad 8 mRNA 1.159±0.139 1.088±0.134□▽1.512±0.137＊△▽3.780±0.167＊△□Smad 4 mRNA 1.045±0.053 1.063±0.094□▽2.450±0.113＊△▽▲3.428±0.046＊△□

4 討論

卵泡的發育是一個連續變化的動態過程，需要多種因素的調節，除了各種垂體釋放的激素以外，卵泡發育還依賴于各種生長因子的作用，這其中TGF-β超家族起關鍵性的作用［9］。目前認為，TGFβ超家族的成員與Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結合，與Ⅰ型受體共同作用啟動信號傳導［1］。Ⅰ型受體主要有3種，分別為BMPR-IA、BMPR-IB及ActR-I(又稱Alk-3、Alk-6及Alk-2)。Ⅱ型受體主要有3種，分別為BMPR-Ⅱ、ActR-ⅡA及ActR-ⅡB。Smads是TGF-β超家族下游信號傳導分子，可將胞外信號從細胞膜傳遞入細胞核，在TGF-β信號傳導過程中發揮重要作用。

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是屬于TGF-β超家族的多肽蛋白，其主要功能是誘導骨的發育和形成，并調節哺乳動物生長、細胞分化與凋亡等。BMP-6是骨形態發生蛋白家族成員之一，其基因定位在小鼠的13號染色體上，定位在人的6p24-6p23［10］。在卵泡發育過程中，卵母細胞和顆粒細胞是BMP-6的主要來源［11-15］，目前對BMP-6信號途徑的研究還不深入，ALK-2、ALK-3、ALK-6已被鑒定為BMP-6的潛在Ⅰ型受體，其中ALK-2、ALK-6與 BMP-6親和力最強，BMPRⅡ、ActR-ⅡA和ActR-ⅡB被鑒定為潛在的Ⅱ型受體，但尚未確定不同類型卵巢細胞中BMP-6受體的差異［16］。在信號傳導過程中，Ⅱ型受體首先與配體結合形成受體復合物，然后募集Ⅰ型受體使其發生磷酸化而活化，活化的BMPⅠ型受體進而磷酸化細胞內信號受體Smad1、Smad5和Smad8，然后與Smad4形成聚合體，轉入細胞核內直接作用于下游靶基因，或與其他轉錄調節因子一起作用于靶基因［17］。

中醫認為，肝主藏血，女性正常生理功能的經、孕、胎、產都以血為用，故葉天士在《臨證指南醫案》中提出“女子以肝為先天”。肝主疏泄，喜條達，情志失調可導致肝的疏泄功能失常，進而影響女性的生殖功能?！稘幘V目》記載:“情不宣暢，經多不調，故難成孕?！北菊n題組前期研究提示，逍遙丸有調節卵巢功能的作用，可使無排卵大鼠優勢卵泡內見到卵母細胞［18］。逍遙丸是在宋·《太平惠民和劑局方》“逍遙散”的基礎上應用現代生產工藝技術所制成的新型中藥制劑，可疏肝解郁、養血調經。方中柴胡疏肝解郁、條達肝氣;當歸、白芍補氣養血調經;白術、茯苓、甘草健脾益氣，助脾化氣以養肝陰，使營血生化有源，以增加當歸和白芍的養血之功。諸藥合用疏肝解郁、養血活血，佐以健脾使氣血調和、沖任二脈調暢，卵細胞正常發育及排出。

本研究結果顯示，與空白對照組及COH組比較，各治療組小鼠卵母細胞BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白及基因的表達增強，其中疏肝高劑量組的表達優于疏肝低劑量組，疏肝高劑量組BMPR II蛋白及mRNA表達增加，提示逍遙丸可能是通過調節小鼠卵母細胞BMP-6的表達，募集BMP-6Ⅱ型受體BMPRⅡ形成受體復合物，然后募集Ⅰ型受體ALK-2和ALK-6，使其發生磷酸化而活化，活化的Ⅰ型受體進一步磷酸化細胞內信號Smad1/5/8，然后與Smad4結合，從而啟動信號傳導。在這一過程中，疏肝高劑量組的作用明顯優于低劑量組。本實驗從信號通路的角度證實，疏肝法在干預卵泡發育和卵母細胞質量方面效果顯著，進一步豐富了中醫學“肝腎同源”、“精血互化”以及“肝主藏血”、“女子以肝為先天”的理論基礎，也為在臨床干預不孕癥及作為IVF-ET的輔助治療方案提供了堅實的實驗基礎。

［1］ 李春燕，陳子江．生長分化因子-9及生長分化因子-9B與卵巢功能調節［J］．生殖與避孕，2004，26(4):355-399．

［2］ 朱玲．生長分化因子-9在卵泡發育中的作用［J］．國外醫學·計劃生育分冊，2005，24(6):75-79．

［3］ Nilsson E，Skinner M K．Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition［J］．Mol Cell Endocrinol，2004，214: 19-25．

［4］ 于曉妹．從肝論治不孕60例觀察［J］．中國中醫基礎醫學雜志，2004，10(6):461-462．

［5］ 楊麗蕓，杜惠蘭，白靜，等．補腎法、疏肝法對超促排卵小鼠卵母細胞數量及GDF-9表達的影響［J］．中醫雜志，2013，54 (7):597-604．

［6］ 常秀峰，杜惠蘭，高星，等．補腎調經方對輸卵管性不孕癥患者體外受精-胚胎移植超排卵周期GDF-9的影響［J］．中國中西醫結合雜志，2011，31(6):780-783．

［7］ 李秦，朱德生，劉玉林，等．不同激素對哺乳動物超數排卵作用的研究［J］．實驗動物科學與管理，1997，14(3):1-6．

［8］ Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，etal．Cox-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors［J］．Cancer 2000，89(12):2637-2645．

［9］ Nilsson E，Skinner M K．Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition［J］．Mol Cell Endocrinol，2004，214: 19-25．

［10］ Gitelman SE，Kobrin M，Lee A，et al．Structure and sequence of the mouse Bmp6 gene［J］．MammGenome，1997，8(3):212-214．

［11］ Gitelman SE，Kobrin M，Lee A，et al．Structure and sequence of the mouse Bmp6 gene［J］．MammGenome，1997，8(3):212-214．

［12］ Shimizu T，Yokoo M，Miyake Y，et al．Differential expression of bone morphogenetic protein 4-6(BMP-4，-5，and-6)and growth differentiation factor-9(GDF-9)during ovarian development in neonatal pigs［J］．Domest Anim Endocrinol，2004，27(4):397-405．

［13］ Erickson GF，Shimasaki S．The spatiotemporal expression pattern of the bone morphogenic protein family in rat ovary cell types during the estrous cycle［J］．Reprod Biol Endocrinol，2003，1 (5):1-20．

［14］ Hino J，Takao M，Takeshita N，et al．cDNA cloning and genomic structure of human bone morphogenetic protein-3β(BMP-3β) ［J］．Biochem Biophys Res Commun，1996，223(2):304-310．

［15］ Glister C，Kemp CF，Night PG．Bone morphogenetic protein (BMP)ligands and receptors in bovine ovarian follicle cells: actions of BMP-4，-6 and-7 on granulosa cells and differential modulation ofSmad-1 phosphorylation by follistatin［J］．Reproduction，2004，127(2):239-254．

［16］ Ebisawa T，Tada K，Kitajima I，et al．Characterization of bone morphogenetic protein-6 signaling pathways in osteoblast differentiation［J］．Cell Sci，1999，112(Pt 20):3519-3527．

［17］ Yamashita H，Dijke P，Huylebroeck D，et al．Osteogenic protein-1 binds to activin type II receptors and induces certain activin-like effects［J］．Cell Biol，1995，130(1):217-226．

［18］ 羅亞萍，馬惠榮，杜惠蘭，等．逍遙丸對雄激素致無排卵大鼠卵巢功能的影響［J］．河北中醫藥學報，2009，24(3):33-34．

Effect of Xiaoyao Pill on the Expression of BMP-6/Smads Signal Pathway in Mouse Oocytes

YANG Li-yun，DU Hui-lan△，BAI Jing，SUN Xiao-huan，FAN Li-jie
(Hebei University of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050091，China)

Objective:To investigate the effects of Xiaoyao Pill on the expression of BMP-6，BMPR II，ALK-2，ALK-6，Smad1，Smad5，Smad8 and Smad4 in mouse oocytes．Methods:200 mice were randomly divided into 4 groups:Shugan high dose group，Shugan low dose group，COH group and control group(N=50)，the expression of BMP-6，BMPR II，ALK-2，ALK-6，Smad1，Smad5，Smad8 and Smad4 in mouse oocytes were detected by immunohistochemistry and Real-time PCR．Results:Compared with the control group，the protein content and mRNA expression of BMP-6，BMPRII，ALK-2，ALK-6，Smad1，Smad5，Smad8 and Smad4 in the COH group have no statistical significance．the protein content and mRNA expression of BMP-6，ALK-2，ALK-6，Smad1，Smad5，Smad8 and Smad4 in the treatment groups increased．The protein and mRNA expression in Shugan high dose group were higher than the Shugan low group．The protein and mRNA expression of BMPR II in Shugan high dose group were increased．Conclusion:Xiaoyao Pill can improve the expression of BMP-6 in mouse oocytes，activate its second type of receptor BMPRⅡ，and then activate receptors ALK-2/6，the acitvation of type 1 receptors phosporylate intracellular signal Smad1/5/8，then combine with Smad4，and start the signal transduction of Smads pathway to intervene the development and quality of oocytes．．

Xiaoyao Pill;Oocyte;BMPRII;ALK-2;ALK-6;Smad1;Smad5;Smad8;Smad4

R285．5

B

1006-3250(2015)03-0294-04

2014-12-02

國家自然科學基金面上項目(81173294)

楊麗蕓(1979-)，女，河北香河人，講師，醫學博士，從事中醫藥防治生殖內分泌的基礎與臨床研究。

△通訊作者:杜惠蘭(1950-)，女，河北石家莊人，教授，醫學博士，從事中醫藥防治生殖內分泌的基礎與臨床研究，Tel: 13931150880，E-mail:duhuilan@163．com。