煉油廢水中異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的篩選

武文麗，顏家保，紀(jì)南南，曹曉詩(shī)，胡茜茜，吳 優(yōu)

（武漢科技大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081）

煉油廢水中異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的篩選

武文麗，顏家保，紀(jì)南南，曹曉詩(shī)，胡茜茜，吳 優(yōu)

（武漢科技大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081）

從煉油廢水活性污泥中篩選出一株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的菌株WY6。對(duì)篩選菌株進(jìn)行了生理生化實(shí)驗(yàn)和菌種鑒定，考察了碳源種類(lèi)、培養(yǎng)基的m（C）∶m（N）、培養(yǎng)溫度、初始pH及接種量對(duì)菌株硝化性能的影響；并對(duì)其N(xiāo)H3-N去除性能進(jìn)行了考察。經(jīng)鑒定，該菌為鮑曼不動(dòng)桿菌，適宜的培養(yǎng)條件為：以丁二酸鈉為碳源、培養(yǎng)溫度30℃、初始pH 9.0、m（C）∶m（N）=10、接種量2.0%。在此條件下培養(yǎng)20 h，可將NH3-N質(zhì)量濃度由245.46 mg/L降至9.71 mg/L，平均NH3-N去除速率為11.79 mg/（L·h）。WY6菌可在32 h內(nèi)將實(shí)際煉油廢水的NH3-N質(zhì)量濃度由初始時(shí)的73.74 mg/L降至1.15 mg/L，NH3-N去除率達(dá)98.4%，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

煉油廢水；氨氮；異養(yǎng)硝化-好氧反硝化；菌種篩選

煉油廢水含有烴類(lèi)化合物及其衍生物、酚類(lèi)、雜環(huán)化合物、硫化物和氨氮等多種污染物，廢水量大，組分復(fù)雜，難降解有機(jī)物多，COD含量較高［1］。煉油廢水一般采用隔油—?dú)飧　奶幚砉に嚕?］，COD去除效果較好，但廢水中NH3-N的脫除效果常常不穩(wěn)定，生化過(guò)程硝化率低，造成生化后出水ρ（NH3-N）超標(biāo)，不得不增加生物接觸氧化池和生物曝氣濾池等裝置進(jìn)一步處理，提高了廢水的處理成本。煉油廢水生物處理系統(tǒng)的硝化率較低有多方面原因，最主要的可能是某些毒性有機(jī)物對(duì)自養(yǎng)硝化菌的抑制。而異養(yǎng)硝化菌能利用有機(jī)碳源，可消除有機(jī)物的抑制作用，從而提高煉油廢水的硝化效果，并達(dá)到同時(shí)脫碳脫氮的目的。

本工作從煉油廢水生物處理活性污泥中分離得到異養(yǎng)硝化-好氧反硝化高效菌，對(duì)篩選菌株進(jìn)行了生理生化實(shí)驗(yàn)和菌種鑒定，考察了碳源種類(lèi)、培養(yǎng)基的m（C）∶m（N）、培養(yǎng)溫度、初始pH及接種量對(duì)菌株硝化性能的影響；并對(duì)其N(xiāo)H3-N去除性能進(jìn)行了考察，旨在為煉油廢水的新型生物脫氮技術(shù)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料和儀器

活性污泥：取自中國(guó)石化武漢分公司煉油廢水生化處理裝置。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蛋白胨10 g，pH=7.1～7.5，加蒸餾水定容至1 L。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基：丁二酸鈉9.54 g，Na2HPO4·12H2O 8.0 g，KH2PO41.5 g，（NH4）2SO41.0 g，MgSO40.1 g，F(xiàn)eSO40.01 g，微量元素儲(chǔ)備液2 mL，pH=7.0～7.3，用蒸餾水定容至1 L。

微量元素儲(chǔ)備液：組成見(jiàn)文獻(xiàn)［3］。

反硝化培養(yǎng)基：用0.15 g KNO3替代（NH4）2SO4，其余組分同異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基。

實(shí)際廢水：中國(guó)石化武漢分公司排水車(chē)間氣浮隔油后的煉油廢水，COD=600～800 mg/L，ρ（NH3-N）=60～80 mg/L，pH=8～9。

所用試劑除酵母提取物、蛋白胨外，其余均為分析純。

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；QYC21型恒溫?fù)u床：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；752N型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；1-14型小型離心機(jī)：德國(guó)SIGMA公司。SA3500-85型雙目顯微鏡：北京泰克儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的富集和篩選

取少量活性污泥接種于LB培養(yǎng)基中活化，然后轉(zhuǎn)接至異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中多次馴化，對(duì)馴化后的菌液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)捎闷桨鍎澗€(xiàn)法進(jìn)行純化，得到異養(yǎng)硝化菌株；對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行硝化性能測(cè)試，將硝化能力較好的菌株再接種至好氧反硝化培養(yǎng)基中多次馴化，再經(jīng)分離純化得到同時(shí)具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力的菌株。

1.2.2 菌種鑒定

選取篩選得到的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能最好的一株細(xì)菌作為高效菌，進(jìn)行菌種鑒定和特性研究：依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［4］進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗(yàn)；用溶菌酶-CTAB-蛋白酶K法［5］提取DNA，委托北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rDNA序列分析。

1.2.3 培養(yǎng)條件的選擇

將篩選所得高效菌接入LB培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液離心，收集菌體，再用無(wú)菌水洗滌2次，然后將菌體重懸浮于無(wú)菌水中，調(diào)節(jié)菌體濃度，使菌液于600 nm處的光密度約等于1，制成菌懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將菌懸液按一定接種量（φ，%）接種至以NH3-N為唯一氮源的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，ρ（NH3-N）=212.02 mg/L，在搖床轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下培養(yǎng)，分別考察碳源種類(lèi)、m（C）∶m（N）、培養(yǎng)溫度、初始pH及接種量對(duì)菌株硝化性能的影響。

1.2.4 煉油廢水中NH3-N的降解

將篩選得到的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌按一定接種量接種于100 mL氣浮后的實(shí)際煉油廢水中，考察菌株在最佳培養(yǎng)條件下對(duì)實(shí)際廢水中NH3-N的去除效果。

1.3 分析方法

細(xì)菌生長(zhǎng)量采用光密度法測(cè)定［6］；ρ（NH3-N）采用納氏試劑分光光度法測(cè)定［7］。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種鑒定

經(jīng)分離純化，獲得12株同時(shí)具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力的菌株。選取1株硝化和反硝化綜合性能最好的菌株（命名為WY6）進(jìn)行研究。在異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基上，WY6菌落呈乳白色，圓形，中間凸起，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，無(wú)水溶性色素產(chǎn)生，革蘭氏染色呈陰性。該菌不能水解淀粉和明膠，產(chǎn)生H2S；甲基紅反應(yīng)呈陽(yáng)性，而二乙酰反應(yīng)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)呈陰性。WY6菌的菌落形態(tài)和革蘭氏染色菌體的顯微鏡照片見(jiàn)圖1。

菌株WY6通過(guò)16S rDNA測(cè)序后，將所得堿基序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA 5.0軟件計(jì)算序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，構(gòu)建菌株WY6的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，在進(jìn)化過(guò)程中與菌株WY6親緣關(guān)系最近的均為鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）。結(jié)合WY6的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征，將其鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌。

圖1 WY6菌的菌落形態(tài)（a）和革蘭氏染色菌體（b）的顯微鏡照片

圖2 菌株WY6的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 培養(yǎng)條件

2.2.1 碳源

WY6為異養(yǎng)硝化菌，可以利用培養(yǎng)基或廢水中的有機(jī)碳源。在m（C）∶m（N）=8、培養(yǎng)溫度為30 ℃、初始pH為7.1、接種量為2.0%的條件下，將WY6分別接種至以葡萄糖、蔗糖、乳糖、丁二酸鈉和檸檬酸鈉為碳源的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，考察碳源種類(lèi)對(duì)NH3-N去除效果的影響。碳源種類(lèi)對(duì)ρ（NH3-N）的影響見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)：分別以丁二酸鈉和檸檬酸鈉為碳源時(shí)，ρ（NH3-N）下降速率最快，以蔗糖為碳源時(shí)居中，以葡萄糖、乳糖為碳源時(shí)最慢；當(dāng)以丁二酸鈉為碳源、培養(yǎng)時(shí)間為26 h時(shí)，ρ（NH3-N）由212.02 mg/L 降至8.52 mg/L。這可能是因?yàn)閃Y6菌能直接利用丁二酸鈉和檸檬酸鈉，而以葡萄糖、乳糖為碳源時(shí)，還原性糖與氨類(lèi)物質(zhì)在高壓蒸汽滅菌時(shí)會(huì)在高溫條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)，部分生成難以利用的大分子物質(zhì)的緣故［8］。因此，WY6菌適宜的碳源為丁二酸鈉，這與陳趙芳等［9-10］的研究結(jié)果類(lèi)似。

圖3 碳源種類(lèi)對(duì)ρ（NH3-N）的影響

2.2.2 m（C）∶m（N）

Joo等［11］的研究結(jié)果表明，m（C）∶m（N） 是影響異養(yǎng)硝化菌NH3-N去除效果的重要因素。在以丁二酸鈉為碳源、培養(yǎng)溫度為30 ℃、初始pH為7.1、接種量為2.0%的條件下，m（C）∶m（N）對(duì)ρ（NH3-N）的影響見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)：m（C）∶m（N）越高，NH3-N去除效果越好，反之則越差；當(dāng)m（C）∶m（N）大于10時(shí)，3條ρ（NH3-N）去除曲線(xiàn)幾乎重合。說(shuō)明有機(jī)碳源是WY6菌生長(zhǎng)的限制性因素，碳源越豐富越有利于NH3-N的去除。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，m（C）∶m（N）取為10。

圖4 m（C）∶m（N）對(duì)ρ（NH3-N）的影響

2.2.3 培養(yǎng)溫度

培養(yǎng)溫度主要影響微生物酶的活性，從而影響其生長(zhǎng)和代謝［12］。在以丁二酸鈉為碳源、m（C）∶m（N）=10、初始pH為7.1、接種量為2.0%的條件下，培養(yǎng)溫度對(duì)ρ（NH3-N）的影響見(jiàn)圖5。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)ρ（NH3-N）的影響

由圖5可見(jiàn)：培養(yǎng)溫度為20～30 ℃時(shí)，隨培養(yǎng)溫度的升高，NH3-N去除效果變好；當(dāng)培養(yǎng)溫度進(jìn)一步升高至37 ℃時(shí)，NH3-N去除效果變差。這可能是由于酶的活性受到一些抑制，使NH3-N的去除速率放緩。由此可見(jiàn)，WY6菌適宜的培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.2.4 接種量

接種量的大小影響細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖速率，采用較大的接種量可以縮短細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間，但接種量過(guò)大容易引起溶氧不足，而且也不經(jīng)濟(jì)；相反，接種量過(guò)小則會(huì)延長(zhǎng)細(xì)菌的延滯期。在以丁二酸鈉為碳源、m（C）∶m（N）= 10、培養(yǎng)溫度為30 ℃、初始pH為7.1的條件下，接種量對(duì)ρ（NH3-N）的影響見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)，接種量在2.0%～10.0%范圍內(nèi)的NH3-N去除效果相差不大。考慮到方法的經(jīng)濟(jì)性，將WY6菌接種量定為2.0%。

圖6 接種量對(duì)ρ（NH3-N）的影響

2.2.5 初始pH的影響

溶液酸堿度是影響硝化作用的重要因素［13］。在以丁二酸鈉為碳源、m（C）∶m（N）=10、培養(yǎng)溫度為30 ℃、接種量為2.0%的條件下，初始pH對(duì)ρ（NH3-N）的影響見(jiàn)圖7。

圖7 初始pH對(duì)ρ（NH3-N）的影響

由圖7可見(jiàn)：初始pH在4.0～9.0范圍內(nèi)時(shí)，提高初始pH可加快NH3-N的去除，即弱堿性區(qū)間內(nèi)的NH3-N去除速率較中性及弱酸性區(qū)間快，這是由于弱酸性不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致NH3-N的去除速率緩慢；在初始pH為9.0、培養(yǎng)時(shí)間為20 h時(shí)，ρ（NH3-N）由245.46 mg/L 降至9.71 mg/L，平均NH3-N去除速率為11.79 mg/（L·h）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WY6菌適宜的初始pH與實(shí)際廢水的pH較為接近，方便該菌的實(shí)際應(yīng)用。

2.3 WY6菌對(duì)煉油廢水中NH3-N的去除效果

在最佳條件下，WY6菌對(duì)煉油廢水中NH3-N的去除效果見(jiàn)圖8。由圖8可見(jiàn)：WY6菌能很快適應(yīng)實(shí)際廢水環(huán)境，且接種量為0.5%和2.0%時(shí)NH3-N的去除效果相當(dāng)；當(dāng)接種量為0.5%時(shí)，煉油廢水經(jīng)32 h處理后，ρ（NH3-N）由初始時(shí)的73.74 mg/L降至1.15 mg/L，NH3-N去除率達(dá)98.4%。該菌表現(xiàn)出良好的硝化能力和潛在的應(yīng)用前景。

圖8 WY6菌對(duì)煉油廢水中NH3-N的去除效果

3 結(jié)論

a）通過(guò)硝化培養(yǎng)基富集、馴化，從煉油活性污泥中篩選出一株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的菌株WY6，經(jīng)鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌。

b）菌株WY6的適宜培養(yǎng)條件為：以丁二酸鈉為碳源、培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH 9.0、培養(yǎng)基的m（C）∶m（N）=10、接種量2.0%。在此條件下培養(yǎng)20 h，可將NH3-N質(zhì)量濃度由245.46 mg/L降至9.71 mg/L，NH3-N平均去除速率為11.79 mg/（L·h）。

c）WY6菌對(duì)實(shí)際煉油廢水具有良好的NH3-N去除能力，可在32 h內(nèi)將NH3-N質(zhì)量濃度由初始時(shí)的73.74 mg/L降至1.15 mg/L，NH3-N去除率達(dá)98.4%，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

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（編輯 葉晶菁）

Screening of Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrification Strain from Refinery Wastewater

Wu Wenli，Yan Jiabao，Ji Nannan，Cao Xiaoshi，Hu Xixi，Wu You
（College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China）

A heterotrophic nitrif i cation-aerobic denitrif i cation bacteria strain WY6 was isolated from activated sludge in the refinery wastewater treatment system. The WY6 was characterized and identified by physiological and biochemical experiments. The effects on nitrif i cation ability of the strain were studied，such as carbon source，m（C）∶m（N） of the medium，culture temperature，initial pH and inoculation amount. And its NH3-N removal ability was also investigated. The identif i cation results show that WY6 is a strain of Acinetobacter baumannii，and the suitable culture conditions for it are as follows：using sodium succinate as carbon source，culture temperature 30 ℃，initial pH 9.0，m（C）∶m（N）=10，inoculation amount 2.0%. When the ref i nery wastewater has treated under these conditions for 20 h，the NH3-N mass concentration can be decreased from 245.46 mg/L to 9.71 mg/L with 11.79 mg/（L·h） of average ammonia removal speed. After treated for 32 h by strain WY6，the NH3-N mass concentration of the actual ref i nery wastewater can be decreased from73.74 mg/L to 1.15 mg/L with 97.8% of NH3-N removing rate，which shows a good application prospect.

refinery wastewater；ammonia nitrogen；heterotrophic nitrification-aerobic denitrification；strain screening

X172

A

1006-1878（2015）04-0354-05

2015 - 03 - 18；

2015 - 04 - 29。

武文麗（1990—），女，甘肅省白銀市人，碩士生，電話(huà) 18971048322，電郵 121135637@qq.com。聯(lián)系人：顏家保，電話(huà) 18062689295，電郵 yanjb9198@126.com。

武漢科技大學(xué)研究生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（JCX0006）；武漢科技大學(xué)國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310488009）。