MBR系統好氧反硝化效果及好氧反硝化菌的鑒定

李曉樓

（四川職業技術學院 建筑與環境工程系，四川 遂寧 629000）

研究報告

MBR系統好氧反硝化效果及好氧反硝化菌的鑒定

李曉樓

（四川職業技術學院 建筑與環境工程系，四川 遂寧 629000）

采用間歇曝氣法對MBR系統好氧反硝化菌進行了培養和富集，考察了系統的好氧反硝化效果及其影響因素，并對好氧反硝化菌進行了分離和鑒定。實驗結果表明：在DO為2.0～3.0 mg/L、m（C）∶m（N）為8∶1的條件下，MBR系統好氧反硝化效果較好，COD、氨氮、TN的去除率分別達到90%，90%，62%左右；從系統活性污泥中得到11株好氧反硝化性能較好的好氧反硝化菌，它們屬于變形菌門，分別屬于不動桿菌屬、叢毛單胞菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬和噬氫菌屬。

生物脫氮；膜生物反應器；好氧反硝化菌；菌種鑒定

近年來，國家對水質標準和水處理要求的提高，對生物脫氮技術的發展提出了更高要求。傳統生物脫氮技術存在較多不足之處，如硝化菌群增殖速度慢、需進行污泥和硝化液的回流、系統抗沖擊能力較弱以及脫氮酸堿度需調節等［1］。

研究發現，在好氧硝化池中常有超出微生物增殖所需的氮的去除，損失的總氮量高達30%［2］。這種好氧過程中的脫氮現象是由好氧反硝化菌引起的。與傳統生物脫氮技術相比，好氧反硝化菌脫氮具有以下優點：1）使硝化/反硝化反應在同一個反應器中進行，可大幅減少占地面積和建設資金；2）可減少調節系統pH的化學藥劑用量，降低成本；3）好氧反硝化菌在處理過程中更易控制［3］。

目前，在多種生物處理系統中都發現了好氧反硝化過程的存在，如好氧曝氣池和SBR系統［4-5］。由于生長條件和競爭等因素限制，好氧反硝化菌不易篩選和富集，而采用生物固定化技術和MBR能夠有效地保留和富集好氧反硝化菌［6-7］。通過對生物處理系統中好氧反硝化菌的分離篩選和鑒定，了解系統中好氧反硝化菌的生長條件，有利于調控生物處理系統，保證好氧反硝化過程的順利進行［8-9］。同時，對好氧反硝化菌的分離篩選有助于強化生物脫氮過程［10］。

本工作采用間歇曝氣法對MBR系統好氧反硝化菌進行了培養和富集，考察了系統的好氧反硝化效果及其影響因素，并對好氧反硝化菌進行了分離和鑒定，以期為MBR系統好氧反硝化菌的培養及系統調控提供理論基礎和技術支持。

1 實驗部分

1.1 試劑、材料和儀器

溴百里酚藍（BTB）分離培養基：KNO31 g，KH2PO41 g，FeC120.5 g，CaCl20.2 g，MgSO4·7H2O 1 g，丁二酸鈉8.5 g，1%（w）BTB無水乙醇溶液1 mL，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

反硝化培養基：KNO31 g，KH2PO41 g，FeCl20.5 g，CaCl20.2 g，MgSO4·7H2O 1 g，琥珀酸鈉4.5 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

微量元素溶液：乙二胺四乙酸5.0 g，CaCl20.5 g，ZnSO40.3 g，MnCl2·4H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.5 g，CuSO4·5H2O 0.2 g，CoCl2·6H2O 0.2 g，蒸餾水1000 mL，pH=6.0。

FM培養液：牛肉膏1.0 g，蛋白胨5.0 g，KNO31.0 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

DM培養液：Na2HPO4·7H2O 7.9 g，KH2PO41.5 g，KNO30.3 g，微量元素溶液1 mL，蒸餾水1000 mL，pH=7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

廢水：人工配制的模擬廢水，主要成分為FM培養液2%（w）、DM培養液3%（w）、實際生活污水（取自四川省遂寧市某生活區）10%（φ）。廢水的水質見表1，廢水pH控制在6.3～7.5。

活性污泥：取自四川省某污水處理廠污泥濃縮池的好氧污泥，呈絮狀，沉降性能良好。

DYCP-34A型瓊脂糖水平電泳儀：北京六一儀器廠；CARY300型紫外-可見分光光度計：美國Varina公司；HQ30d型便攜式溶氧儀：HACH公司；BS210S型電子天平：美國賽多利斯天平有限公司。

表1 廢水的水質 mg/L

1.2 MBR系統運行參數

MBR：自制，采用聚偏氟乙烯（PVDF）纖維實驗型膜片制成內徑為20 cm、高度約120 cm的圓柱形玻璃容器，有效容積30 L。系統基本運行參數：HRT=12 h，MLSS=6～8 g/L，SRT=20～30 d；DO控制在0.5～5.0 mg/L，通過控制曝氣量進行調節；m（C）∶m（N）控制在（3～12）∶1，通過改變Na3C6H5O7·2H2O投加量進行控制。MBR系統的運行參數見表2。

1.3 好氧反硝化菌的培養與富集

采用間歇曝氣法對MBR系統中好氧反硝化菌進行培養和富集［11］。該方法利用好氧反硝化菌可同時將O2和NO3-作為電子受體的特性，將好氧、缺氧條件進行轉換，能夠完全抑制好氧菌和厭氧菌的正常生長，促使好氧反硝化菌在競爭中取得優勢地位。經過30 d培養，系統在好氧條件下脫氮效果達到穩定，TN去除率維持在30%～40%。

表2 MBR系統的運行參數

1.4 好氧反硝化菌的篩選

從MBR中取10 mL泥水混合液，與90 mL反硝化培養基混合，置于30 ℃搖床內培養24 h。將活性污泥培養液按一定比例稀釋，取適量涂布于BTB分離培養基上，置于30 ℃恒溫培養箱內培養48 h。挑取使培養基顯色（藍色）的單菌落至BTB分離培養基上，經5～6次劃線純化分離得純菌株，于4 ℃保存。

1.5 好氧反硝化菌的鑒定

采用Chelex法提取好氧反硝化菌DNA：取1 mL 37 ℃振蕩培養后的菌液于1.5 mL離心管中，以8000 r/min的轉速離心1 min，去除上清液，加入1mL Trizol試劑，得DNA提取液。

參照文獻［12］報道的方法進行16S rRNA基因的擴增。擴增引物序列為上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和下游引物5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增程序為：99 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（共30個循環）；72 ℃延伸10 min。

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至深圳華大基因研究院進行16S rRNA基因序列的測定。參照文獻［13］報道的方法將16S rRNA基因序列（約700 bp）導入EzTaxon-e基因庫進行BLAST比對分析。

1.6 分析方法

按照文獻［14］報道的方法進行水質的測定。其中，采用重鉻酸鉀法測定COD；采用納氏試劑光度法測定氨氮；采用過硫酸鉀氧化—紫外分光光度法測定TN；采用便攜式溶解氧儀法測定DO；采用酚二磺酸光度法測定硝酸鹽氮；采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法測定亞硝酸鹽氮。

挑取篩選提純的菌落至LB液體培養基中，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，將培養液離心，用生理鹽水洗滌，分別挑取一環接種至100 mL反硝化培養基中，37 ℃振蕩培養24 h。測定反應前后培養基中的硝態氮和亞硝態氮的質量濃度，按下式計算菌株的總脫氮率（η，%）。

η=［ρ（初始硝態氮）-ρ（反應后硝態氮）-ρ（反應后亞硝態氮）］/ρ（初始硝態氮）×100%

2 結果與討論

2.1 MBR系統的處理效果

MBR系統的處理效果見圖1。由圖1可見：在30 d的啟動期中，COD去除率在前10 d逐漸增加，在11～30 d期間，微生物適應進水水質后，COD去除率逐漸穩定，基本維持在90%左右；氨氮去除率在前16 d內總體呈上升趨勢，系統的硝化能力逐步加強，在馴化階段后期，氨氮去除率趨于穩定，達到90%左右；TN去除率在馴化初期呈現出一定的波動性，23 d后穩定在40%左右，可認為此時好氧反硝化菌落結構已趨于穩定。

圖1 MBR系統的處理效果

2.2 DO對好氧反硝化效果的影響

階段2考察了DO對MBR系統處理效果的影響。由圖1可見：當DO為0.5～1.0 mg/L（31～37 d）時，由于DO的不足，造成系統COD、氨氮的去除效果及反硝化效果不佳；隨DO的增加，COD、氨氮的去除效果及反硝化效果逐漸提升；當DO為2.0～3.0 mg/L（45～51 d）時，COD、氨氮的去除效果恢復至正常水平，同時反硝化效果達到最優。

DO對MBR系統TN去除率的影響見圖2。

圖2 DO對MBR系統TN去除率的影響

由圖2可見：當DO為0.5～1.0 mg/L時，好氧反硝化效果不佳，TN去除率維持在20%以下；隨DO的增加，好氧反硝化效率呈先增后降的趨勢；當DO為2.0～3.0 mg/L時，好氧反硝化效率達到最高，TN去除率達40%；DO繼續增至3.0～5.0 mg/L時，TN降至34%。

綜上所述，DO對好氧反硝化效果影響較大。低DO條件下，細胞活性降低，導致細胞生長率和反硝化率降低，硝酸鹽還原酶處于抑制狀態。此時，脫氮主要是通過傳統缺氧反硝化過程，有利于N2生成［15-16］。高DO條件下，微生物活性增加，聚β-羥基丁酸得以積累而利于快速脫氮，使得好氧反硝化順利進行［17］。曝氣時間過長，好氧反硝化菌體開始衰亡，數量減少，活性降低［18］，從而導致TN去除率出現下降。

2.3 有機碳源對好氧反硝化效果的影響

階段3考察了m（C）∶m（N）對MBR系統處理效果的影響。由圖1可見：隨m（C）∶m（N）的增大，COD、氨氮的去除效果未受明顯影響，去除率維持在90%左右；好氧反硝化效果隨m（C）∶m（N）的增大而逐漸提升，當m（C）∶m（N）增至8∶1（69～74 d）時，好氧反硝化效果提升最為明顯。

m（C）∶m（N）對MBR系統TN去除率的影響見圖3。由圖3可見：好氧反硝化效果隨m（C）∶m（N）的增大而逐漸提升，當m（C）∶m（N）增至8∶1時，好氧反硝化效率提高明顯，TN去除率達62%左右；m（C）∶m（N）繼續增至12∶1，好氧反硝化效率提高不明顯，TN去除率升至68%左右。

圖3 m（C）∶m（N）對MBR系統TN去除率的影響

綜上所述，有機碳源對好氧反硝化過程發揮著重要作用，且m（C）∶m（N）越大反硝化效果越好。這是因為：充足的碳源能夠為微生物提供足夠的能量，使反硝化作用更徹底；同時，硝酸鹽還原酶表達基因調控蛋白FNR對周圍電子供體和受體變化敏感，相對較高的m（C）∶m（N）激活了好氧反硝化菌相關反硝化基因的表達［19］；而低m（C）∶m（N）時，碳源快速消耗，碳源的不足造成反硝化過程受阻。

2.4 好氧反硝化菌群的鑒定結果

MBR系統經長期馴化后，活性污泥經分離純化得到11株好氧反硝化性能較好的細菌，利用基因庫比對11株好氧反硝化細菌的16S rRNA基因序列，其中，有11個與已知物種相近的不同序列，且與已知物種序列的相似性達到98%以上，它們屬于變形菌門（Proteobacteria），分屬于不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）、叢毛單胞菌屬（Comamonas sp.）、氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）和噬氫菌屬（Hydrogenophaga sp.）。本實驗11條16S rRNA基因序列的GenBank登錄號為KF984303～KF984313。

11株細菌中，總脫氮率在60%以上的有8株。而一般微生物脫氮的最佳效果也僅為30%（總脫氮率），由此可見，從系統中分離出的好氧反硝化菌具有較好的好氧反硝化性能［20-21］。

李安峰等［7］的研究結果表明，在SBR和MBR系統中分離出的高性能好氧反硝化菌屬變形菌門，這與本研究的結果相符。這些好氧反硝化菌在屬和種水平上表現出豐富的多樣性，它們的存在使得MBR系統好氧反硝化效果得以維持和穩定。同時，不同系統好氧反硝化菌群落結構的差異性也為系統好氧反硝化提供了菌株資源。

3 結論

a）在DO為2.0～3.0 mg/L、m（C）∶m（N）為8∶1的條件下，MBR系統好氧反硝化效果較好，COD、氨氮、TN的去除率分別達到90%，90%，62%左右。

b）通過對系統活性污泥中好氧反硝化菌的分離和鑒定，得到11株好氧反硝化性能較好的好氧反硝化菌，它們屬于變形菌門，分屬于不動桿菌屬、叢毛單胞菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬和噬氫菌屬。

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（編輯 魏京華）

Aerobic Denitrification Effect of MBR and Identification of Aerobic Denitrlfier

Li Xiaolou
（Architecture and Environmental Engineering Department，Sichuan Vocational and Technical College，Suining Sichuan 629000，China）

Aaerobic denitrlf i ers were cultivated and enriched in MBR system by the method of intermittent aeration. The aerobic denitrif i cation effect of MBR and the affecting factors were studied，and the aerobic denitrlf i ers were separated and identif i ed. The experimental results show that： When DO is 2.0-3.0 mg/L and m（C）∶m（N） is 8∶1，the aerobic denitrif i cation effect of MBR system is good，and the removal rates of COD，NH4+-N and TN are about 90%，90% and 62% respectively；11 strains of aerobic denitrlf i erwith good aerobic denitrif i cation capability are isolated from the MBR activated sludge，which belong to Proteobacteria and are Acinetobacter sp.，Comamonas sp.，Aeromonas sp.，Pseudomonas sp. and Hydrogenophaga sp.，respectively.

biological denitrif i cation；membrane bio-reactor；aerobic denitrlf i er；strain identif i cation

X703

A

1006-1878（2015）04-0339-05

2015 - 03 - 20；

2015 - 06 - 03。

李曉樓（1974—），男，四川省遂寧市人，碩士，副教授，電話 15244943011，電郵 lixiaolou_1234@163.com。