高濃度槲皮素對G6PD缺乏者體外紅細胞的影響

董金濤+++++陳麗++++梁麗紅

[摘要] 目的 研究高濃度槲皮素對G6PD缺乏者體外紅細胞的影響。 方法 選取G6PD活性正常、缺乏的檢驗者各50例，采集外周血并與槲皮素孵育，測定紅細胞的GSH、MetHb，并對紅細胞的形態學變化進行觀察，考察槲皮素對G6PD活性缺乏者紅細胞影響。 結果 槲皮素對G6PD缺乏者紅細胞具有明顯的氧化作用，GSH呈下降趨勢，而MetHb則顯著上升（P<0.05），高濃度組MetHb為（5.70±2.03）%顯著高于中、低濃度組（3.51±1.67）%、（1.31±0.68）%，差異有統計學意義（P<0.05）；缺失組與正常組受到α-萘酚的影響存在明顯差異，且兩種孵育體系中的表現存在不同。 結論 槲皮素對G6PD缺乏者紅細胞有一定的氧化作用，因此在涉及含有氧化性黃酮類化合物病制劑使用時應謹慎。

[關鍵詞] 高濃度槲皮素；G6PD缺乏；紅細胞

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）02-0017-03

G6PD缺乏者指酶活性因X染色體中G6PD基因改變而出現不同程度的遺傳性疾病，主要表現為溶血性貧血與新生兒黃疸，氧化性藥物等眾多因素均可能為其誘因[1]，黃酮類化合物通常有抗氧化活性，可放置活性自由基對機體造成損傷，但使用不當仍可能導致患者出現不同程度的活性自由基損害及細胞凋亡[2]。本次研究針對高濃度槲皮素對G6PD缺乏者紅細胞的影響進行研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究入選的100例受檢者均為男性，在2010年10月～2014年3月在我院接受招募，年齡18～60歲，平均（30.54±7.46）歲，根據G6PD活性分為G6PD活性正常組與G6PD缺乏組，兩組均為50例，正常組活性≥6.70/gHb，缺乏組<6.70/gHb，兩組年齡等基線資料差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 納入標準

①男性；②血常規、肝腎功能及體格檢查正常；③無抽煙、嗜酒等不良嗜好；④4個月內未發生感染性疾病或溶血疾??；⑤兩周內未服用藥物；⑥無其他血液系統疾病；⑦對試驗知情并自愿配合完成試驗。所有患者行血常規、肝腎功能檢查，抽取外周靜脈血20 mL，同時測定G6PD活性與體外活性孵育試驗，上述檢查及試驗均在采取后12 h內完成。研究方案報醫院倫理委員會審批通過。

1.3 儀器及藥物

儀器包括全自動生化分析儀、紫外可見分光光度計、高速冷凍離心機、水浴恒溫振蕩器、全自動血細胞分析儀。藥物于中檢所采購槲皮素與α-萘酚，使用二甲基亞砜將槲皮素配置為1、5、100 mol·L-1濃度的儲備液，α-萘酚使用二甲基亞砜配置為0.4 mg·mL-1儲備液。使用5 mmol·L-1PBS（5 mmol·L-1葡萄糖，140 mmol·L-1氯化鈉，pH7.4稀釋）對儲備液進行稀釋處理，濃度為50%。

1.4 方法

1.4.1 G6PD活性測定 利用7170A全自動生化分析儀對G6PD活性進行測定（連續監測速率法）。通過離心機將EDTA-K2抗凝血5 min離心處理，離心參數為4 000 r/min，避免血漿層干擾吸取20 μL壓積紅細胞，并將其放入1mL溶解液中溶解，待1～2 min紅細胞完全溶解后進行測定。參數設定：1、2試劑分別為220 μL、25 μL；試驗溫度37°C；主波長及副波長分別為340 nm、660 nm；反應時間10min；設置209084為計算因數。以U/L表示結果，后以全自動血細胞分析儀對Hb進行測定，進樣量200 μL取EDTA-K2抗凝血2 mL，最后G6PD活性=G6PD（U/L）/Hb（g/L），并以U/gHb表示結果。

1.4.2 紅細胞孵育 離心全血后分離血漿與白細胞層，壓積紅用4℃等滲PBS洗滌，洗滌三次后再次將40%體積懸浮于PBS中，制備40%紅細胞懸液，加入懈皮素，濃度控制在50、250、500 μmol·L-1三個梯度。分別對應低、中、高組，另外設立α-萘酚組（0.02 mg·mL-1）、DMSO組（5%）和PBS組，在37℃水浴中放置孵育管，并振蕩孵育2 h。剩下的全血和藥物進行孵育，相關設置同上。

1.4.3 GSH測定 還原性谷胱甘肽用比色法測定，將孵育完成后的血樣離心處理（10 min，2000 r），將30 μL紅細胞放置在720 μL蒸餾水中制備溶血液。將300 μL溶血液與1.2 mL GSH試劑混勻后高速離心，后抽取上清液1 mL進行顯色反應，與420 nm處對吸光度進行測定，另外對標準管吸光度和空白管吸光度進行測定，最后計算處GSH含量，公式為GSH=測定管吸光度-空白管吸光度）/（標準管吸光度-空白管吸光度）×20×307×125/104。

1.4.4 MetHb檢測 MetHb即高鐵血紅蛋白，其含量結合630 nm處吸光度的差值，觀察其和Hb轉化為MetHb的比值，用蒸餾水將上述制備溶血液300 μL用閉稀釋為2.55 mL并混勻，將蒸餾水作為空白，在630 nm處測定吸光度A1；加入50 μL氰化鉀溶液，于上述相同波長條件下測定A2。后抽取100 μL溶血液蒸餾水稀釋至2.5 mL，將50 mL高鐵氰化鈉加入，同在630 nm處測定吸光度A3，另加入50 μL測定吸光度A4。利用（A1-A2）/（A3-A4）×100%公式將（MetHb）%計算出來。

1.5 統計學方法

應用SPSS13.0統計學軟件進行數據分析。兩組受試者間的比較采用Students t-test。兩組受試者各藥物組與相應對照組的比較分別采用隨機區組的方差分析，并進行兩兩之間的LSD檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 40%紅細胞懸液G6PD缺乏者GSH及MetHb測定

槲皮素對G6PD缺乏者紅細胞具有明顯的氧化作用，GSH呈下降趨勢，而MetHb則顯著上升（P<0.05），見表1。

表1 40%紅細胞懸液G6PD缺乏者GSH及MetHb測定（x±s）

注：與低濃度比較，t1=4.925，t2=12.201，t3=4.925，t4=16.660，*P<0.05；與中濃度比較t1=8.331，#P<0.05

2.2 α-萘酚與DMSO對GSH及MetHb的影響分析

缺失組與正常組受到的α-萘酚影響存在明顯差異，兩組孵育體系表現差異顯著，見表2。

3 討論

G6PD缺乏者由于紅細胞中還原性谷胱甘肽對氧化性物質有對抗作用，使得血紅蛋白、膜脂質受到影響，氧化后變為高鐵血紅蛋白，促使交聯細胞及Heinz形成，使形態結構出現明顯變化，最終可能導致紅細胞破溶，另可能導致經內皮網狀系統清除[3]。D6PD缺乏者紅細胞氧化性損害可不斷累積，因此必須防止降低紅細胞GSH提高氧化性壓力的干擾[4]。

紅細胞損傷程度受氧化物質損傷的影響受到紅細胞壓積的影響，當紅細胞壓積較小時，氧化損傷程度則越高。一般情況下成年男性的紅細胞壓積值約為40%～50%，因此選擇40%紅細胞懸液孵育體系對藥物影響紅細胞氧化作用的考察更為有利[5]?？寡趸镔|、脂質、蛋白等物質均處于血漿中，全血中紅細胞氧化程度輕微，其檢測客觀性較高，可準確反映出生理狀態[6]。

α-萘酚可能引發患者發生溶血性貧血，使GSH水平降低，另可提高MetHb水平上升。槲皮素氧化作用較強，在中濃度下即導致可造成較大的氧化性損傷，同時其能夠使全血中G6PD缺乏者紅細胞Hb發生氧化的物質[7]。

有研究顯示，包含槲皮素在內的眾多黃酮類化合物對正常者紅細胞及干細胞均有一定的氧化作用[8，9]，除懈皮素外的黃酮類化合物大多需和過氧化物酶/H202發生反應以參與這一過程，與黃酮類化合物催化氧化機制符合，但同時無法對其非催化氧化作用做出解釋[10]。有研究顯示[11，12]，懈皮素脂性大，可直接氧化Hb，蘆丁具有較高的親水性，較難透過細胞膜直接氧化Hb，所以不會對G6PD缺乏者、正常者的MetHb和紅細胞GSH產生明顯影響。

本次研究對不同濃度槲皮素對G6PD缺乏者紅細胞的氧化作用進行研究，而其氧化機制還需深入研究，可以確定的是槲皮素會提高缺乏者的氧化性壓力，從而產生氧化性損傷。因此G6PD患者應謹慎使用，防止長期使用高濃度的槲皮素，尤其是新生兒、兒童及感染或遺傳性溶血性疾病等患者應避免使用。

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（收稿日期：2014-09-23）