代謝組學技術在植物源性食品研究中的應用研究進展

趙 丹，杜仁鵬，劉鵬飛，潘 超，葛菁萍，*

（1.黑龍江大學生命科學學院，微生物黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500）

代謝組學技術在植物源性食品研究中的應用研究進展

趙 丹1，2，杜仁鵬1，2，劉鵬飛1，2，潘 超1，2，葛菁萍1，2，*

（1.黑龍江大學生命科學學院，微生物黑龍江省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.農業微生物技術教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500）

代謝組學以生物系統中的細胞在特定條件下所有小分子代謝物為研究對象，定性并定量描述生物內源性代謝物及其對內因和外因變化的應答規律。近年來代謝組學技術成為食品科學研究中不可或缺的工具，尤其是在以植物為原材料進行加工或直接食用的植物源性食品中，代謝組學技術廣泛用于檢測不易揮發性化合物。本文簡要介紹代謝組學主要技術平臺、研究流程和統計方法，著重論述代謝組學在植物源性食品的品質鑒定、安全性及防偽評估、原料動態監控以及食品分類中的應用現狀及發展趨勢。

代謝組學；植物源性食品；核磁共振；質譜

20世紀70年代，Devaux等［1］基于代謝輪廓分析（metabolic profiling）第一次提出代謝組學（metabolomics）概念。之后Nicholson等［2］于1999年重新定義了代謝組學，并利用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術分析大鼠的尿液，對生物體內隨時間改變的代謝物進行動態檢測、定量、分類，從而尋找相關的生物標志物。代謝組學技術可同步實時定量分析細胞、器官、生物體內維持其正常生長和功能的小分子代謝物或化學分子（＜1 500 u）［3］。

植物源性食品（plant-derived food）指以植物為原材料進行加工或直接食用的健康安全食品，其質量保證和生產過程需要有高度規范、統一的標準［4］。代謝組學允許同時表征大量化學分子和生物材料，為植物源性食品提供詳細、準確的代謝物構成分析［5］。通過大量研究發現，在食品研究中，充分利用代謝組學這個研究工具，可建立靈敏可靠特異的快速檢測方法，使得食品中小分子化學物質的分離鑒別相對快速簡易，并已經成功用于食品原材料和最終產品的質量鑒定［6］。代謝組學能夠分析所有代謝物的集合，系統研究代謝物的變化規律，被認為是具有潛在應用價值的工具，為食品科學相關研究提供了新思路和技術。本文主要介紹代謝組學技術作為一種工具，在植物源性食品的品質鑒定、安全把控、加工貯藏、產品分類中的應用，以及如何運用代謝組學技術分析和鑒定植物源性食品進行簡要的概述和展望。

1　代謝組學研究的一般流程

完整的代謝組學分析的流程是指對代謝物進行分離、檢測、數據處理及分析的過程。經研究發現，并不是每一個步驟都是必需的，分離和檢測被認為是代謝組學技術的核心部分，樣品處理之后，選擇一種能分析出所有代謝物的技術手段至關重要［7］。其中分離技術包括：氣相色譜（gas chromatogram，GC）、毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）和液相色譜（liquid chromatogram，LC）。由于這些技術具有技術成熟、易掌握、檢測靈敏度高、分離效能高、選擇性高、檢出限低、樣品用量少、方便快捷等特點，已被廣泛應用于食品工業的安全評估中［8］。代謝組學檢測平臺中最常用的是質譜（mass spectrometry，MS）和NMR技術，MS技術具有靈敏度高、樣品用量少、分析速度快、可鑒定待測物結構等優點，廣泛應用于食品科學研究中，特別是其快速定性功能使其在植物揮發性代謝產物分析中得到廣泛應用［9］。NMR圖譜可以使NMR波信號在樣品中定位，為進行食品內部結構的直觀透視研究提供強有力的技術手段，對植物源性食品加工和貯藏過程中的生化反應以及化學變化進行跟蹤研究［10］。數據處理及分析主要包括化學物質定性定量和統計學分析，分離的化學物質通過色譜數據庫檢索并和標準品的保留時間進行對比來定性鑒別，代謝組學數據分析以多維數據分析（multivariate data analysis，MVDA）為主［11］。由于數據量非常大，采用常規統計分析方法既難以發現樣品之間或各組之間的異同，也難以發現樣品中的哪些變量（分子）造成上述差異。因此代謝組學數據需要特殊方法加以分析，其中應用最廣泛的是主成分分析（principal components analysis，PCA），它可以用來歸類區分不同處理樣品之間的不同。除此之外，還有非線形映射（nonlinear mapping，NLM）、聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）等非監督學習方法和軟獨立建模分類法（soft independent modeling of class analogy，SIMCA）、偏最小二乘法顯著分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和神經網絡分析（artificial neural network，ANN）等有監督學習方法［12］。常用的代謝組學分析軟件有MATLAB、SAS、SPSS、SIMCA等［13］，可根據研究需要選擇合適的方法。

2　植物源性食品的品質特征鑒定

代謝組學詳細而全面的分子圖像對在評估食品質量、分析不同食品中的揮發性化合物，以及鑒別不同物種之間的差異和相近特征的準確性上起著決定性的作用［14］。在植物源性食品研究中，一個樣品中通常含有多種代謝產物，特別是一些高分子質量不易揮發的極性代謝產物，研究這些物質需要進行化學衍生化或者高溫處理，方法和步驟比較復雜，要求較高。目前，氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）、液相色譜-質譜聯用（LC-MS）、NMR技術為不同品種作物的生物活性化合物提供一個快速可行的檢測手段。有報道稱NMR技術可以定性分析西紅柿中的特異性糖類、黃酮苷、氨基酸和有機酸化合物，這些物質與西紅柿的口味、香味、成熟階段和顏色微妙變化密切相關［10］。Choi等［15］利用NMR對韓國豆醬的生產過程進行了實時檢測，并通過PCA發現豆醬發酵過程中糖的質量分數下降，乙酸、酪氨酸、苯丙氨酸等質量分數顯著增加。Ali等［16］利用NMR耦合MVDA，通過研究葡萄酒的性狀來評定葡萄酒的感官品質，結果發現葡萄在成熟期間果漿化學成分的變化影響酒的質量，對其感官品質有重要的影響。其后，Lee等［17］用GC-MS和1H-NMR與PLS-DA模型聯用技術構建葡萄酒的代謝圖譜，來預測葡萄酒的口感黏度分數，結果顯示脯氨酸、乳酸、醋酸、酒石酸、蘋果酸和甘油對葡萄酒口感起著至關重要的作用。研究者采用流動注射電噴霧電離質譜（flow injection electrospray ionization mass spectrometry，FIE-MS）和GC-MS評估馬鈴薯的化學組成，不同品種的馬鈴薯塊莖中代謝物組分與馬鈴薯品質特征聯系密切，其中某些品種的氨基酸（異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）含量較高。GC-MS結果顯示極性代謝物（氨基酸、有機酸、糖和糖醇）和非極性代謝物（包括脂肪酸、脂肪醇和甾醇）差異顯著［18］。Tarachiwin［19］和Pongsuwan［20］等把GC-MS、1H-NMR、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared chromatography，FTIR）和超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術結合起來，用于鑒別綠茶質量等級，并且分析出影響茶葉質量的特征性化合物。

3　植物源性食品安全性及防偽評估

代謝組學技術在植物轉基因食品的測定中具有靈敏、準確的優勢。Roessnner等［21］利用GC-MS對馬鈴薯塊莖中150 種化合物進行了定量和定性分析，確定了過表達葡萄糖激酶和葡萄糖磷酸酶基因轉基因植株的生物化學表現型。Catchpole等［22］用FTIR和NMR對轉基因馬鈴薯和非轉基因馬鈴薯做了比較分析，多維數據分析結果顯示二者之間并無顯著區別。這表明代謝組學能快速而簡便地評估轉基因產品成分組成差異。

原料摻假是假冒偽劣食品生產中的慣用手段，很難通過味道或顏色檢測出來。Vardin等［23］在FTIR光譜信息的基礎上開發出一種快速敏感、高通量且重現性好的分析手段，用于檢測果汁真偽。Ogrinc等［24］利用同位素比質譜法（isotope ratio mass spectrometry，IRMS）選取摻假的果汁、葡萄酒和橄欖油樣品，同時以合格產品為對照，通過PCA或ANN分析結果來區分摻假產品和合格產品。Christy等［25］利用色譜技術結合其他化學計量學技術鑒別摻入豆油、玉米油、核桃油的偽劣橄欖油，結果表明：偏最小二乘法的應用可以預測橄欖油中摻入豆油、玉米油、核桃油的誤差，結合PCA分析結果可以100%地區分出橄欖油中是否摻假。這些研究表明，代謝組學技術不但可以快速，低成本地識別摻假飲料和油，還可以準確的監測轉基因食品的質量問題。

4　植物源性食品原料種植、產品加工、貯存過程中的監控

水果在生長成熟過程中，其內部的水分含量與狀態、可溶性碳水化合物及油脂含量等都會相應變化。通過對這些成分的測定，即可預知水果的成熟度［26］。Carrari等［27］用液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜（liquid chromatography-quadrupole-time of flightmass spectrometry，LC-Q-TOF-MS）和高效液相色譜-二極管陣列檢測-熒光檢測技術（high performance liquid chromatography-diode array detector-fluorescence detection，HPLC-DAD-FD），對不同成熟階段番茄果實組織中代謝物的圖譜進行比較，區分不同發育階段并檢測各階段的標志性代謝產物。le Gall等［28］研究了番茄成熟過程中茄紅素等一系列代謝產物的動態變化，對番茄的成熟機制有了進一步的了解，為加快番茄成熟速度打好了基礎。Ku等［29］利用1H-NMR耦合GC-MS技術研究綠茶發酵特征，結果表明綠茶發酵過程中表兒茶素、表兒茶素-3-沒食子酸酯、奎尼酸、咖啡因和蔗糖的質量分數不斷下降，而沒食子酸和葡萄糖的質量分數不斷增加。此外，代謝組學技術也可作為采摘后水果生理生化狀況的評估工具，為水果的貯存方式選擇和營銷策略提供依據。Kushalappa等［30］利用GC-MS檢測水果采摘初期頂部空間的揮發性代謝物來診斷水果疾病，從而幫助人們尋找提高水果保質期的方法。Bianchi等［31］基于揮發性代謝產物的代謝輪廓構建了一種新的GC-MS技術，能夠盡早檢測到橙汁的腐敗情況，結果發現被污染的樣品中萜醇和酮等揮發性物質的含量增加，而α-里哪醇、萜烴類和線性醛等物質含量下降。

5　植物源性食品溯源

Hong-Seok等［32］運用1H-NMR檢測了不同品種（Campbell，Early，Cabernet Sauvignon and Shiraz）和來自不同國家和地區（澳大利亞、法國、美國加州和韓國）的葡萄所生產葡萄酒的差異。Son等［33］將NMR和GC-MS結合起來，檢測2，3-丁二醇、乳酸、乙酸、脯氨酸、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、甘油、酒石酸鹽、葡萄糖和酚類代謝物，然后運用PCA和PLS分析實現了對葡萄酒的分類。Vaclavik等［34］的研究利用LC-Q-TOF-MS對來自歐洲和美國的不同地理環境的不同種類葡萄酒進行分類，結果表明矢車菊素-3-O-葡萄糖苷是葡萄酒分類的主要指標。此外，代謝組學技術在植物油的來源及品質鑒定中應用廣泛。Ruiz-Samblás等［35］運用 GC-MS指紋圖譜獲得了三酰甘油圖譜，1-棕櫚酸-2-硬脂酸-3-油酸甘油酯和1，2-油酸甘油酯-3-硬脂酸是區別特級初榨油、初榨橄欖油、橄欖油和果渣油這4 種橄欖油樣品的主要代謝產物。Mata-Espinosa等［36］利用高效液相色譜-電霧式檢測器（high performance liquid chromatography-charged aerosol detection，HPLC-CAD）區分不同類別和品種的橄欖油、食用油（玉米、向日葵、花生大豆、油菜籽、芝麻、葡萄籽）和一些混合油，其中三油酸甘油酯、1，2-油酸-3-棕櫚酸和1，2-油酸-3-甘油三亞油酸酯作為區分橄欖油和植物油的鑒別性代謝物。研究表明，NMR與GC-MS聯用極大促進了植物源性食品的分類，不僅可以準確地鑒定不易揮發性代謝產物，還可以同時構建多種代謝產物的代謝圖譜，為飲料、酒、油的分類提供現實可行的保障手段。

6　結 語

代謝組學是后基因組時代新興的一種生物表型研究手段，旨在通過一系列的最新科技成果整合代謝產物信息，是系統生物學研究的重要部分。代謝組學技術已經廣泛應用到微生物學、植物學、食品學、毒理學和藥物學研究中，正朝著整合化、自動化和高通量的方向發展［37］。然而，多方面因素又制約著代謝組學技術在食品科學中的廣泛使用。首先，代謝組學發展的時間較短，分析對象是無偏向性的樣品中所有小分子物質，對分析手段的要求比較高，并且各種技術都各有所長，怎樣進行優勢互補，使得各種分析技術的數據能統一、交叉驗證是一個亟待解決的問題。其次，代謝組學仍屬于一種技術潛力尚待開發的新興學科領域，目前僅有一部分代謝產物已得到識別，仍有相當大的一部分代謝產物未被鑒定，這也成了代謝組學在食品科學中發展的障礙［38］。

對于植物源性食品原料，代謝物組成復雜、含量不一，樣品在制備過程中流程不統一，以及植物揮發性代謝產物的分析技術尚不完善，許多分析方法僅停留在對植物源性食品組分的定性和初步定量上。植物源性食品研究缺乏系統的研究模式，其中采樣、分析技術和數據處理是研究難點，這主要是由于植物揮發性代謝產物濃度低、物質種類多、從極性到非極性跨度大、理化指標各異且常伴隨復雜基體，而采樣和分析過程中又要求保持其生物活性，導致檢測的難度較大［39］。因此，植物源性食品及其原料代謝物的分析檢測，尤其是現場快速檢測是當前該領域的熱點和難點。代謝組學技術在植物源性食品研究中的應用，將呈現以下兩個趨勢：一是將代謝組學技術及數據方法有機結合，有針對性的建立快速、分辨率高、靈敏度強的檢測平臺和規范統一的檢測流程，將有助于促進植物源性食品的發展；二是將代謝組學技術與其他系統生物學技術和高通量數據分析方法結合，有助于我們深入了解植物源性食品代謝物與其所處生態環境中的生物和非生物因素的響應關系，進而幫助我們深入了解并監控植物源性食品產業鏈的各個環節。

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A Review of Applications of Metabolomics Techniques in Plant-Derived Food Research

ZHAO Dan1，2， DU Renpeng1，2， LIU Pengfei1，2， PAN Chao1，2， GE Jingping1，2，*
（1. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Microbiology， College of Life Science， Heilongjiang University， Harbin 150080， China；2. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology， Ministry of Education， Harbin 150500， China）

Metabolomics is defined as the quantitative and qualitative measurement of all the endogenous small-molecule metabolites within a biological system as well as its dynamic response to external and internal factors. In recent years，metabolomics techniques have become important research tools in food science and have been widely applied in the detection of nonvolatile compounds present in plant-derived materials used for processing or direct consumption. This paper summarizes the major technical platforms， research procedures and statistical methods involved in metabolomics. The current applications and future trends of metabolomics techniques in authentication and classification of plant-derived foods，assessment of their quality and safety， and dynamic monitoring of the raw materials.

metabolomics； plant-derived food； nuclear magnetic resonance （NMR）； mass spectrometry （MS）

TS201；C39

A

1002-6630（2015）03-0212-05

10.7506/spkx1002-6630-201503041

2014-05-08

國家自然科學基金青年科學基金項目（31300355）；國家自然科學基 金面上項目（31270534）；哈爾濱市科技局青年后備人才項目（2014RFQXJ101）；黑龍江大學杰出青年基金項目（JCL201305）；黑龍江省高等學校科技創新團隊項目（2012td009）

趙丹（1980—），女，副教授，博士，研究方向為微生物生態學。E-mail：zhaodan4u@163.com

葛菁萍（1972—），女，教授，博士 ，研究方向為微生物學。E-mail：gejingping@126.com