乙醇脅迫對乳酸桿菌關鍵酶活力的影響*

朱敏，李寶坤，李開雄，盧士玲，王慶玲，蔣彩虹，樊哲新，蔣琰潔，趙冠東

1(石河子大學 食品學院，新疆 石河子，832000)2(陜西華秦農牧科技有限公司，陜西楊凌，712100)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類革蘭氏染色呈陽性的桿菌或球菌，對葡萄糖發酵能產生50% 以上乳酸的一類微生物的總稱［1］。在乳酸菌中，乳酸桿菌是最大的一個屬，是目前發酵產品市場中重要的發酵劑，也是一種頗受關注的益生菌，具有重要的經濟價值。由于外界各種不良環境的脅迫及不利因素的影響，嚴重地限制了乳酸桿菌的生長及代謝能力，進而影響了益生功能的發揮，抑制了高效活性的利用［2］。從生理或分子生物學的角度了解脅迫耐受性的機制是必要的，脅迫可定義為能引起生長速率或存活率降低的基因、蛋白或環境方面的一種變化［3］。在實際應用過程中，菌體所經歷的脅迫環境往往是復雜和交互的。發酵制品如酸馬奶酒、葡萄酒、發酵乳飲料等都由乳酸菌與酵母菌共同發酵而成［4］，其發酵過程中所產生的代謝產物，造成生存環境不斷地改變，菌體不可避免的受到各種脅迫條件的影響，如溫度、pH、乙醇、滲透壓等，其中乙醇是最常見的脅迫因子之一［5］。一般體積分數4%的乙醇含量就可抑制菌體的生長速率［6］。李愛霞［7］，秦偉帥［8］等研究發現乙醇濃度過高就會影響菌體的新陳代謝、生理活性等。Graca等［9-10］研究認為，在乙醇體積分數為8%～10%的條件下，細菌的生長會受到明顯抑制，12.5%以上的乙醇不僅抑制細菌的生長，甚至會造成菌體的大量死亡［11］。乙醇屬有機溶劑，對菌體的毒害主要表現在對細胞膜的破壞上，乙醇滲入膜結構改變它們的組織和功能，影響基體的酶活性［12］，增加細胞膜的通透性，造成胞內物質流失［13］，關鍵酶變性失活，致使正常生理代謝調控失常，存活率降低。目前對于乳酸桿菌在乙醇脅迫條件下的生理狀態研究頗少。探究乙醇脅迫對乳酸桿菌的損傷機理，確定乙醇脅迫后影響菌體正常代謝的關鍵酶是很有必要的。本文以面包乳桿菌(Lactobacillus crustorum D2-5)和植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum D5-5)作為研究對象，分別選取乙醇體積分數為5%和8%進行脅迫處理與不加乙醇的樣品進行菌種活力的對比，測定乙醇脅迫處理后菌體存活率及乙醇脅迫對糖酵解過程中關鍵酶的影響，分析乙醇脅迫造成菌體失活的主要因素，并對其機理進行探究。

1 材料與方法

1.1 原料

面包乳桿菌D2-5和植物乳桿菌D5-5均來自石河子大學食品學院畜產實驗室;培養基MRS;考馬斯亮藍G-250;己糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶及ATP酶試劑盒，均由南京建成生物公司提供;無水乙醇及其他試劑，均為分析純。

1.2 主要儀器設備

紫外可見光分光光度計，鄭州中譜儀器有限公司;臺式高速冷凍離心機，力康發展有限公司;電子分析天平，上海第三天平儀器廠;生物培養箱，上海精密誓言設備有限公司;高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠;渦旋振蕩器，金壇市醫療儀器廠;超聲破碎儀，南京舜瑪儀器設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同乙醇體積分數脅迫對乳酸桿菌存活率的測定

收集對數生長末期的菌體，離心(4℃，10 000 r/min，5 min)。細胞經0.85%的生理鹽水洗滌2次后重懸于等體積不同乙醇體積分數的MRS培養基中，脅迫2 h。脅迫后的菌懸液經0.85%的生理鹽水洗滌2次后重懸于等體積生理鹽水中，取1 mL重懸液，稀釋不同梯度涂布于平板上測定存活率。37℃下培養24 h，實驗重復3次，每次3個平行樣品。

式中:NA為未添加乙醇的活菌數;NB為不同乙醇體積分數脅迫后的活菌數［14］。

1.3.2 己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)、ATP酶的測定

1.3.2.1 無細胞提取液的制備

菌體活化后，按2%的接種量分別接到體積分數為5%、8%的乙醇液體培養基中培養，體積分數為離心(4℃，4 000 r/min，10 min)收集生長至對數末期的菌體，用無菌磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 7.4)或0.85%生理鹽水洗滌2次。取4 mL在冰水浴中進行超聲破碎(工作時間∶間歇時間=3s∶9s)，持續5 min。離心(4 ℃，6 000 r/min，10 min)，取其上清液用于相關酶活性的測定［2］。

1.3.2.2 蛋白質的測定

考馬斯亮藍染色法［15］。

1.3.2.3 相關酶活性的測定

己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)、ATP酶均采用南京建成生物公司相應的試劑盒進行測定。

1.4 數據統計分析

采用Excel軟件作圖，SPSS數據處理軟件Oneway ANOVA法對實驗數據進行方差顯著性分析，P＜0.05為顯著水平。

2 結果與分析

2.1 不同乙醇體積分數脅迫對乳酸桿菌存活率的影響

經不同乙醇體積分數脅迫培養條件下，收集對數末期的菌體，觀察菌體的生長情況如圖1所示。本研究通過乙醇體積分數分別為5%、8%脅迫處理后，以不加乙醇的樣品作為對照。由圖1可以看出，乳酸桿菌在5%乙醇脅迫處理后，相對于對照來說，面包乳桿菌D2-5與植物乳桿菌D5-5存活率分別提高了27.11%和17.20%。但是體積分數為8%乙醇脅迫處理后，存活率明顯下降，面包乳桿菌D2-5、植物乳桿菌D5-5存活率僅為26.61%和23.50%。這一結果說明，5%乙醇脅迫處理提高了菌體的存活率，使得細胞膜的通透性增加，促進細胞內外質子或其他離子的交換，增強了菌體新陳代謝的能力［16］，進而使得菌體存活率提高。而8%乙醇脅迫處理對菌體的生長產生明顯的抑制作用，生長速率及存活率明顯降低。

2.2 不同乙醇體積分數脅迫處理后對乳酸桿菌己糖激酶(HK)的影響

己糖激酶廣泛存在于動植物及和微生物體內，作用于D-葡萄糖、果糖和甘露糖，是糖酵解過程中的第1個調節酶，其活性大小與乳酸菌的糖代謝速率相關。規定在37℃，pH 7.6的條件下，1 mg組織蛋白在反應體系中每分鐘生成1 mmol的NADPH定義為1個酶活力單位。本研究測定不同乙醇濃度脅迫處理后對其活力的影響，研究結果如圖2所示。

由圖2可以看出，不同乙醇體積分數脅迫的乳酸桿菌隨著乙醇濃度的升高，己糖激酶活力有所降低，效果不顯著。不同的乳酸桿菌之間存在個體差異性，在5%乙醇脅迫處理條件下，植物乳桿菌D5-5酶活力稍微高于未加乙醇的對照。乙醇脅迫處理之前己糖激酶活力為(4.51±0.50)U，而脅迫之后卻為(4.72±0.94)U相對于未經乙醇脅迫的對照組來說，均不具有顯著性。酶活力的變化與菌體活力相關，在8%乙醇脅迫處理條件下，2株乳桿菌均具有極顯著性差異(P＜0.01)，其酶活分別為(4.54±0.75)U，(3.12±0.19)U。8%脅迫處理后細胞明顯受到損傷，致使其活力下降。這一結果表明己糖激酶不是乙醇脅迫乳酸菌代謝的主要酶。

2.3 不同乙醇體積分數脅迫處理后對乳酸桿菌丙酮酸激酶(PK)的影響

丙酮酸激酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸轉變為丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸的高能磷酸鍵在催化下轉移給ADP生成ATP，自身生成烯醇式丙酮酸后自發轉變為丙酮酸。反應不可逆。它是糖酵解途徑中第二個以底物水平磷酸化方式生成ATP的反應。丙酮酸激酶是糖酵解途徑中的又一個限速酶。定義為在37℃，pH 7.6的條件下，1 mg組織蛋白每分鐘將1 μmol的PEP轉變成丙酮酸為1個酶活力單位。本研究測定不同乙醇濃度脅迫處理后對其活力的影響，研究結果如圖3所示。

由圖3可以看出，在不同乙醇體積分數脅迫條件下丙酮酸激酶活力有顯著性差異，對于植物乳桿菌D5-5來說，5%乙醇脅迫后的酶活力明顯高于未添加乙醇的對照。脅迫處理后酶活約為(16.74±1.75)U，而未加乙醇中的對照約為(9.29±0.98)U，其活力提高了約80.19%。不同菌株耐乙醇能力的不同，有些菌株在5%乙醇脅迫條件下能促進菌體的生長［17］，增加細胞膜的通透性，加快物質的代謝能力，使其酶活力增強。而對于面包乳桿菌D2-5來說，脅迫處理后的菌體酶活下降了45.96%，乙醇脅迫處理影響細胞膜選擇性維護功能，抑制相關物質代謝的運輸過程，導致酶活力下降［12］，使5%乙醇脅迫效果達到極顯著水平(P＜0.01)。在8%乙醇脅迫條件下，對于面包乳桿菌D2-5來說，乙醇脅迫效果達到極顯著水平(P＜0.01)，脅迫處理后酶活約為(5.52±0.45)U，而未添加乙醇的對照卻約為(12.25±1.32)U。對于植物乳桿菌D5-5來說，乙醇脅迫效果達到了顯著水平(P＜0.05)。8%乙醇脅迫明顯抑制菌體的生長，活力有所降低，面包乳桿菌D2-5和植物乳桿菌D5-5酶活分別降低了54.94%、10.55%。這一結果說明，丙酮酸激酶是乙醇脅迫損傷的關鍵代謝酶。

2.4 不同乙醇體積分數脅迫處理后對乳酸桿菌乳酸脫氫酶(LDH)的影響

乳酸脫氫酶是一種廣泛存在于各種生物體中的酶，將丙酮酸催化還原為乳酸。乳酸脫氫酶活力大小，反應了菌株的產酸能力。定義為1 g組織蛋白37℃與基質作用15 min，反應體系中產生1 μmol丙酮酸為1單位(U/μg蛋白)。本研究測定不同乙醇脅迫處理后乳酸脫氫酶活力的影響，結果如圖4所示。

由圖4可知，不同乙醇體積分數脅迫乳酸桿菌乳酸脫氫酶活明顯低于脅迫之前，并隨著乙醇濃度的升高而降低。與未添加乙醇的對照相比，在5%乙醇脅迫條件下，面包乳桿菌D2-5和植物乳桿菌D5-5酶活分別降低了21.88%、20.00%。而在8%乙醇脅迫條件下，面包乳桿菌D2-5和植物乳桿菌D5-5酶活分別降低了40.63%、37.50%。通過方差分析可知，5%、8%乙醇脅迫均對乳酸脫氫酶影響極顯著(P＜0.01)。這一結果說明乳酸脫氫酶是乙醇脅迫過程中造成乳酸菌損傷的關鍵酶。

2.5 不同乙醇體積分數脅迫處理后對乳酸桿菌ATP酶的影響

ATP酶是廣泛分布的生物膜酶系統，主要維持細胞的正常生理功能，是生物體能量代謝的關鍵酶。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶是2種重要的ATP酶，它們對維持細胞的正常生理功能有著極其重要的作用，Na+-K+-ATP酶是鑲嵌在細胞質膜脂質雙分子層中的一種蛋白質，具有載體和酶的活性，它們催化ATP水解，驅動Na+和K+于細胞膜兩側的對向運輸，能夠調節細胞內Na+、K+的濃度，調節細胞滲透壓從而保持細胞的靜息電位［18］。Ca2+-Mg2+-ATP酶是另一種重要的膜酶，主要功能是調節細胞內 Ca2+和 Mg2+的濃度［14］。本研究測定不同乙醇脅迫處理后對乳酸菌ATP酶的影響，規定每小時每微克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產生1 μmol無機磷的量為1個ATP酶活力單位(U/μg蛋白)。結果如圖5所示，圖 a為 Na+-K+-ATP酶，圖 b為Ca2+-Mg2+-ATP酶。

由圖5可以看出，在不同乙醇濃度脅迫條件下ATP酶活力有極顯著性差異，對于兩種乳桿菌來說，經5%、8%乙醇脅迫后 Na+-K+-ATP酶和 Ca2+-Mg2+-ATP酶相對于未經乙醇脅迫均具有極顯著性差異(P＜0.01)。對于Na+-K+-ATP酶來說，面包乳桿菌D2-5和植物乳桿菌D5-5均隨著乙醇濃度的升高，活力依次降低。經5%乙醇脅迫后活力分別降低了53.53%、64.44%，而8%乙醇脅迫酶活力分別降低了56.57%、81.11%。對于Ca2+-Mg2+-ATP酶來說，植物乳桿菌D5-5經5%、8%乙醇脅迫后，酶活力分別降低了46.67%、78.33%，但是由于菌種之間存在差異性，面包乳桿菌D2-5在5%乙醇脅迫過程中，Ca2+-Mg2+-ATP酶活力升高了35.42%，8%乙醇脅迫后降低了42.71%，說明在5%乙醇脅迫處理后菌體細胞膜的通透性增大，物質代謝能力增強，致使其酶活力偏高。這一結果表明ATP酶是乙醇脅迫乳酸桿菌過程中另一關鍵酶。

3 討論

酵母進行乙醇發酵過程中，自身產生乙醇，達到一定濃度時，對酵母本身具有毒性，當然對與之相互作用的乳酸菌來說，更是不可避免。不同乙醇體積分數對菌體細胞損傷程度不同。乙醇脅迫可能同時作用或者連續作用，抑制菌體生長及發酵能力，影響菌體的存活率，降低發酵效率［19］。研究表明，不同菌株對乙醇的耐受性不同，菌株的乙醇耐受性與細胞膜的特性及內部環境有關［2］。本文采用不同濃度對不同乳酸桿菌進行脅迫處理，結果表明5%乙醇脅迫處理有助于提高菌體存活率，但是效果不顯著。在此脅迫過程中，乙醇可能促使細胞膜的通透性增大，物質代謝速率加快，反而會促進菌體生長，代謝酶活力提高。8%乙醇脅迫處理后，存活率明顯下降，菌體的生長受到嚴重抑制，致使相關酶活力降低。這一結果與李愛霞［6］，陳偉帥［7］，Graca da Silveira 等［9-10］等研究結果一致，乙醇體積分數超過8% ～10%時，就會明顯抑制乳酸菌的生長。乙醇作為有機溶劑具有親水性的同時又涉及本身的固有毒性。研究發現，乙醇侵入細胞時，最先停留在細胞膜上，引起細胞膜表面性質的改變，如總能量的狀態、主動運輸系統及膜結構的變化等［20］。同時乙醇具有很強的滲透能力，可以直接進入菌體內部，破壞蛋白質顆粒的水化膜，在等電點時使蛋白質沉淀，破壞了蛋白質構象，進而引起蛋白質變性。研究探討的己糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶及ATP酶均屬于蛋白酶，乙醇侵入會直接破壞蛋白質結構，導致酶蛋白變性，而使酶活力降低。乙醇對乳桿菌脅迫處理是一個比較復雜的過程，乙醇脅迫機理及菌體生長過程涉及影響因素頗多，進而乙醇脅迫對乳桿菌代謝活力的影響有待進一步探究。研究乳桿菌生長的過程中乙醇脅迫損失的關鍵因素，并采取有效可行的保護策略，為提高工業發酵過程中菌體存活率提供理論依據，更為工業化生產一體化奠定基礎。

4 結論

(1)在乙醇脅迫處理過程中，5%乙醇脅迫處理有助于提高菌體存活率，但是效果不顯著。在5%乙醇脅迫條件下，面包乳桿菌D2-5與植物乳桿菌D5-5存活率分別提高了27.11%和17.20%。

(2)8%乙醇脅迫處理后，存活率明顯下降，面包乳桿菌D2-5與植物乳桿菌D5-5僅為26.61%、23.50%。菌體的生長受到嚴重抑制，致使相關酶活力降低。

(3)乙醇脅迫處理對乳酸桿菌己糖激酶的影響不顯著，而對丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶及ATP酶具有顯著或極顯著性差異。這一結果說明，丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶及ATP酶是乙醇脅迫影響菌體損失的關鍵酶，而酶活力的變化與菌體的活力相關。

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