機械預處理對酶解啤酒糟提取阿魏酰低聚糖的影響*

張秋培，尤夢竹，蔡國林1，，曹鈺

1(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學生物工程學院，江蘇無錫，214122)

3(江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫，214122)

4(江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

啤酒糟(brewer's spent grain，BSG)是啤酒生產中最大宗的副產物，干啤酒糟總蛋白含量約14%，總脂肪約13%，纖維素約11.5%，木質素約11.9%，半纖維素約40%，還含有少量的淀粉(2.9%)和灰分(3.2%)［1-2］，是良好的蛋白質源和膳食纖維源。目前啤酒糟的主要用途是作為反芻動物飼料，利用率低，浪費嚴重;個別廠家還將濕啤酒糟直接排放，對環境造成嚴重影響。因此，利用恰當的方法挖掘啤酒糟的高值化利用價值，提高經濟效益和社會效益，變廢為寶，成為國內外研究者普遍關注的熱點。如提取啤酒糟中的蛋白質和阿拉伯木聚糖作為食物成分［3］;采用阿魏酸酯酶從啤酒糟中提取酚酸［1］;利用啤酒糟配以一定比例的玉米粉，通過雙菌種制曲來生產營養食醋［4］;添加其他輔料，通過固態發酵來生產飼用木聚糖酶［5］等。

在植物細胞壁中，阿魏酸很少以游離態存在，而是與細胞壁中的多糖、低聚糖、多胺、酯類和木質素交聯構成細胞壁的一部分［6-7］，用適度的酸或多糖水解酶水解啤酒糟細胞壁多糖，可得到不同聚合度的功能性阿魏酰低聚糖(feruloyl oligosaccharides，FOs)。FOs是阿魏酸與低聚糖通過酯鍵結合在一起形成的化合物，兼具阿魏酸和低聚糖的生理功能，如能調節人體的生理機能，具有抗血栓、抗動脈粥樣硬化、降血脂、抑菌、消炎等功能［8］，同時能促進鈣的吸收，調節胃腸道功能等［9］，由于其含有特殊的酯鍵，有些生理功能還有所增強［10］。目前提取FOs的方法有物理法、化學法和生物法［11］，較為常用的是酸法和生物酶法，如葛麗花分別采用草酸和三氟乙酸水解小麥麩皮制得了 FOs［12］;袁小平［13］、葛麗花［12］、姚惠源［14］均用木聚糖酶水解小麥麩皮制得了不同聚合度的FOs，Sorensen等［15］運用β-木糖苷酶和真菌半纖維素酶的混合物水解水不溶性小麥阿拉伯木聚糖，從而釋放出FOs，Katapodis等［16］將玉米穗軸經超聲波或高溫蒸煮處理后，用來自熱子囊菌的10-β-D-內切木聚糖酶水解，從而獲得FOs，Katapodis等也將木聚糖內切酶作用于小麥面粉來提取FOs［17］。但是，啤酒糟作為富含粗纖維的豐富原料，目前還未見有從啤酒糟中提取FOs的研究。

本文旨在通過對啤酒糟進行不同預處理，進而比較預處理后啤酒糟中與FOs相關的一些物質的含量，從而選擇一種相對有利于提取FOs的處理方式，將啤酒糟開發成具有高附加值的產品，改善生態環境，提高經濟效益和社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

啤酒糟由青島啤酒上海松江有限公司提供。

1.1.2 試驗中所用主要試劑

木聚糖酶、纖維素酶均購買于帝斯曼(中國)有限公司，酶的活性如表1所示。NaOH、乙酸乙酯、MOPS、FeCl3、濃 HCl、無水乙醇、葡萄糖、木糖等，均為國產分析純。

1.1.3 儀器與設備

Q-150A3刀片粉碎機，上海冰都電器有限公司;球磨機，長沙天創粉末技術有限公司;H1850R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;PL2002/EL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-2100紫外可見分光光度計，尤尼科(上海)儀器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;FE20實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司;MICROTRAC S3500激光粒度分析儀，美國Microtrac;IKA RV10旋轉蒸發儀，上海楚柏實驗室設備有限公司。

1.2 啤酒糟的預處理

將濕啤酒糟(含水量60%)經過60℃干燥成為啤酒糟原樣。機械預處理方式為刀片粉碎和刀片粉碎后球磨，將適量樣品刀片粉碎3 min，刀片粉碎后的啤酒糟再分別球磨15 min和30 min。

1.3 粒徑分布

MICROTRAC激光粒度分析儀測定不同方式處理的樣品的粒徑分布。

1.4 電鏡掃描

對不同方式處理過的啤酒糟進行電子顯微鏡掃描(scanning electron microscope，SEM)加速電壓50 kV，放大倍數2 000×，通過電鏡掃描圖觀察不同機械預處理方式下啤酒糟原料表面形態的變化。

1.5 不加酶提取FOs

準確稱取樣品0.35 g，加入MOPS緩沖液(100 mmol/L，pH 5.0)5 mL，使底物質量濃度為70 g/L，50℃水浴反應6 h，于100℃加熱10 min，4 500 r/min離心10 min，取上清液，用 MOPS緩沖液(100 mmol/L，pH 5.0)稀釋，測定FOs的含量。

1.6 酶解制備FOs

木聚糖酶酶解實驗:準確稱取樣品0.35 g，加入酶液5 mL，使底物質量濃度為70 g/L，加木聚糖酶(BAKEZYME HSP 6000 BG)酶量為100 U/g底物，50℃水浴反應6 h，100℃滅酶10 min，4 500 r/min離心10 min，取上清液，用 MOPS緩沖液(100 mmol/L，pH 5.0)稀釋，測定FOs的含量。

纖維素酶酶解實驗:纖維素酶酶量為1.36 U/g底物，其他條件與木聚糖酶酶解實驗條件相同，檢測酶解液中FOs的含量。

1.7 協同酶解制備FOs

準確稱取樣品0.35 g，加入酶液5 mL，使底物質量濃度為70 g/L，加木聚糖酶(BAKEZYME HSP 6000 BG)酶量為100 U木聚糖酶活力/g底物，加纖維素酶酶量為1.36 U纖維素酶活力/g底物，50℃水浴反應6 h，然后于100℃滅酶10 min，4 500 r/min離心10 min，取上清液，用 MOPS 緩沖液(100 mmol/L，pH 5.0)稀釋，測定FOs的含量。

1.8 FOs的測定

采用雙波長法測定樣品中的FOs，以MOPS緩沖液(100 mmol/L，pH 5.0)為對照，在286 nm和325 nm處測定稀釋到一定倍數的酶解液中的FOs的含量［18］。

已知對于阿魏酸:ε286nm=14 176，ε325nm=103 501

對于 FOs:ε286nm=12 465，ε325nm=19 345

列方程組:A286nm=14 176bC1+12 465bC2

A325nm=103 501bC1+19 345bC2

式中:ε表示摩爾吸光系數;A286nm表示被測液在286 nm處的吸光值;A325nm表示被測液在325 nm處的吸光值;b表示比色皿的厚度;C1表示阿魏酸的濃度，mol/L;C2表示 FOs的濃度，mol/L。

1.9 FOs的提取率計算

參考Szwajgier所采用的堿提法檢測啤酒糟中的阿魏酸的含量［19］，假設阿魏酸全部以結合態存在，則FOs的得率為:

式中:Q表示單位質量啤酒糟中提取到的FOs的量，μmol/g(啤酒糟);m表示單位質量啤酒糟中阿魏酸的含量，μg/g(啤酒糟);194.19指阿魏酸的摩爾質量。

1.10 數學分析方法

采用excel 2003進行單因素方差分析，探究數據間的差異顯著性。

2 結果與討論

2.1 機械預處理對啤酒糟粒徑分布的影響

經60℃干燥的啤酒糟原料，呈梭形、長8～12 mm、直徑3～4 mm，啤酒糟機械預處理后的粒徑分布如圖1所示。

由圖1可知，經過機械處理后啤酒糟顆粒明顯變小，刀片粉碎的樣品主要粒徑分布集中在100～700 μm，而刀片粉碎后經過不同時間球磨的啤酒糟的粒徑都有一定程度的變小，其中，球磨15 min的啤酒糟原料主要粒徑分布集中在10～350 μm，55.67%的粒徑小于100 μm，球磨30 min的啤酒糟原料主要粒徑分布集中在10～200 μm，76.78%的粒徑小于100 μm。由于顆粒越小，越容易聚集在一起，因此粉碎得越細的的啤酒糟的粒徑大小的值可能比實際值偏大。啤酒糟經刀片或球磨處理后，其顆粒減小，理論上酶解時其接觸的有效表面積增大，在一定程度上可以促進酶水解，更有利于FOs的提取。

2.2 機械預處理對啤酒糟表面形態的影響

啤酒糟經不同方法處理后進行電鏡掃描，不同預處理后啤酒糟表面形態結構的變化如圖2所示，各圖視野放大倍數均為2 000×。從圖2中可以清楚看出，啤酒糟經不同機械處理后，原有的結構完全被破壞，塊狀結構逐步碎裂成細小顆粒，粗糙程度變大，其中刀片粉碎后球磨30 min的啤酒糟基本無大的塊狀顆粒存在，且粉碎度均勻。與2.1中不同預處理的啤酒糟的粒徑分布相符。啤酒糟中皮殼本身的緊密結構是導致酶解效率低的原因之一，啤酒糟經機械預處理后緊密度降低，粒徑變小，反應面積增大，將有利于酶解反應的進行。

2.3 機械預處理對啤酒糟中原有FOs的影響

啤酒糟經不同預處理后其可提取到的FOs的含量如圖3所示，刀片粉碎啤酒糟與原樣中可提取的FOs的量相當，差異不顯著(P＞0.05)，而刀片粉碎后球磨15 min和刀片粉碎后球磨30 min的樣品中可提取的FOs的含量比原樣提高了6.3%和14.4%，差異顯著(P＜0.05)。堿提法檢測啤酒糟中阿魏酸的含量為4469.4 μg/g啤酒糟，則啤酒糟原樣和刀片粉碎后球磨30 min的啤酒糟中 FOs的得率分別為12.34%和14.12%。

FOs是阿魏酸與低聚糖通過酯鍵結合在一起形成的化合物，其中低聚糖主要指低聚木糖，Niemi等［20］研究粉碎預處理對啤酒糟中糖類的酶水解的影響發現，經研磨預處理后，水溶性阿拉伯木聚糖含量由32%提高到了46%，水溶性纖維素的含量由13%提高到了45%，即與木聚糖相比，粉碎預處理對纖維素的降解的影響更大。機械預處理雖然可以部分打破細胞壁結構，提高阿拉伯木聚糖和纖維素的溶解性，但并不能撕裂或斷裂大分子多糖的分子結構，因此粉碎處理并不能大幅度提高FOs的含量。

2.4 機械預處理對木聚糖酶酶解啤酒糟提取FOs的影響

啤酒糟經不同方式預處理后，在相同條件下進行木聚糖酶水解，其結果如圖4所示，經過不同預處理的樣品加木聚糖酶后，可提取的FOs的量是未酶解的樣品的2～3倍，且不同預處理間提取到的FOs的量差異顯著(P＜0.05)。

可見，隨著啤酒糟粒徑的減小和粉碎程度的增加，所提取到的FOs的含量也隨之增加，其中，經木聚糖酶水解后，啤酒糟原樣中提取到的FOs的含量為7.34 μmol/g底物，得率為31.89%，刀片粉碎后球磨30 min的樣品中提取到的 FOs的含量為9.09 μmol/g底物，得率為39.49%，比原樣酶解提高了23.83%。機械預處理可以部分打破細胞壁結構，增加木聚糖和纖維素的溶解性，在木聚糖酶的作用下，木聚糖的分子結構被破壞，并進一步被水解成中小分子，從而促進木聚糖酶的酶解效率，進而提高FOs的提取效率。

2.5 機械預處理對纖維素酶酶解啤酒糟提取FOs的影響

啤酒糟經不同方式預處理后，在相同條件下進行纖維素酶水解，結果如圖5所示，啤酒糟經預處理后提取到的FOs的含量是相應未加酶樣品的34倍，酶解效果優于商品木聚糖酶的酶解效果，且不同預處理間提取到到的FOs的量差異極顯著(P＜0.01)。

不同處理方式處理的啤酒糟，經商品纖維素酶酶解后，提取到的FOs的含量的變化趨勢與商品木聚糖酶酶解時的變化趨勢一致，即隨著粉碎程度的增加，所提取到的FOs的含量也增加。其中，啤酒糟原樣中提取到的FOs的含量為7.69 μmol/g底物，得率為33.41%，刀片粉碎后球磨30 min的樣品中提取到的FOs的含量為 11.59 μmol/g底物，得率為 50.36%，比原樣提高了50.73%。機械預處理降低樣品的致密度和粒徑大小，纖維素酶、β-葡聚糖酶的作用進一步破壞纖維素-半纖維素-木質素的網絡結構，使半纖維素結構暴露出來，木聚糖酶能夠更容易的作用于底物，從而更有利于提取到FOs。

2.6 機械預處理對木聚糖酶纖維素酶協同作用提取FOs的影響

啤酒糟經不同方式預處理后，同時添加商品木聚糖酶和纖維素酶進行酶解，其酶解結果如圖6所示。酶解后提取到的FOs的量是未酶解的相應樣品的4～5倍，同樣，隨著粉碎程度的增加，啤酒糟樣品中FOs的提取量也增加，且不同預處理間FOs的提取量差異極顯著(P＜0.01)，其中啤酒糟原樣中為10.82 μmol/g底物，得率為47.01%，刀片粉碎后球磨30 min的樣品中為 14.73 μmol/g底物，得率為64.00%，比原樣提高了36.14%。

在前期研究木聚糖酶的最佳添加量時發現，加酶量為40 U/g底物時最佳，再增加加酶量，FOs的提取率趨于穩定，結合圖4、圖5和圖6的結果，刀片粉碎后球磨30 min的樣品同時添加纖維素酶和木聚糖酶，FOs的得率由39.49%(木聚糖酶)和50.36%(纖維素酶)，提高到了64.00%，可知，在纖維素酶活力和β-葡聚糖酶活力作用于纖維素后，暴露出半纖維素，可以促進木聚糖酶進一步水解木聚糖，從而使FOs的得率有所增加。

3 結論

啤酒糟經刀片粉碎和球磨后其顆粒直徑顯著變小，從電鏡掃描結果看，增加啤酒糟的球磨時間，顆粒變得更細，同時，對啤酒糟進行預處理，可以提高纖維素的溶解度，從而更有利于制備FOs的關鍵酶作用于底物木聚糖，如，啤酒糟未酶解前，經不同預處理的樣品中提取到的FOs的量相當，經不同酶水解后，可提取到的FOs的量提高了2～5倍。刀片粉碎后球磨30 min的啤酒糟，經商品木聚糖酶和纖維素酶水解后，FOs的得率分別為39.49%和50.36%，經商品木聚糖酶和纖維素酶協同作用后，FOs的得率為64.00%，商品木聚糖酶、纖維素酶協同酶解效果明顯。機械預處理可以在一定程度上提高酶解效率，纖維素酶、β-葡聚糖酶破壞纖維素有利于木聚糖酶的水解作用，綜上，機械預處理和酶的協同作用能夠提高FOs的得率，從而為實現啤酒糟的高值化利用奠定了基礎。

［1］ Szwajgier D，a s ko A，Targoński Z，et al.The use of a novel ferulic acid esterase from Lactobacillus acidophilus K1 for the release of phenolic acids from brewer's spent grain［J］.Journal of the Institute of Brewing，2010，116(3):293-303.

［2］ Xiros C，Topakas E，Katapodis P，et al.Evaluation of Fusarium oxysporum as an enzyme factory for the hydrolysis of brewer's spent grain with improved biodegradability for ethanol production ［J］.Industrial Crops and Products，2008，28(2):213-224.

［3］ Vieira E，Rocha M A M，Coelho E，et al.Valuation of brewer's spent grain using a fully recyclable integrated process for extraction of protein and arabinoxylans［J］.Industrial Crops and Products，2014，52:136-143.

［4］ 楊燕紅，薛業敏.利用啤酒糟生產營養食醋［J］.中國釀造，1999(6):13-14.

［5］ 曾瑩，楊明.發酵啤酒糟產飼用木聚糖酶的基質條件及其酶學性質研究［J］.中國釀造，2006(9):12-15.

［6］ Abokitse K，W MQ，Bergeron H，et al.Thermostable feruloyl esterase for the bioproduction of ferulic acid from triticale bran ［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2010，87(1):195-203.

［7］ Bunzel M.Chemistry and occurrence of hydroxycinnamate oligomers［J］.Phytochemistry Reviews，2010，9(1):47-64.

［8］ 歐仕益，阿魏酸的功能和應用［J］.廣州食品工業科技，2002，18(4):50-53.

［9］ Courtois J.Oligosaccharides from land plants and algae:production and applications in therapeutics and biotechnology［J］.Current Opinion in Microbiology，2009，12(3):261-273.

［10］ 葛麗花.阿魏酰低聚糖的制備及其抗氧化性質的研究［D］.哈爾濱:東北林業大學，2007:1-67.

［11］ YU X H，GU Z X.Direct production of feruloyl oligosaccharides and hemicellulase inducement and distribution in a newly isolated Aureobasidium pullulans strain ［J］.World Journal of MicrobIology and Biotechnology，2014，30(2):747-755.

［12］ 葛麗花.阿魏酰低聚糖的制備及其抗氧化性質的研究［D］.東北林業大學，2007:1-67.

［13］ 袁小平.酶解麥麩制備阿魏酰低聚糖及其生物活性的研究［D］.無錫市:江南大學，2006:1-120.

［14］ 姚惠源，胡敏，袁小平，等.酶法制備阿魏酰低聚糖的研究［J］.食品與機械，2008，24(4):3-7.

［15］ Sorensen H R，Pedersen S，S Meyer A.Characterization of solubilized arabinoxylo-Oligosaccharides by MALDITOF MS analysis to unravel and direct enzyme catalyzed hydrolysis of insoluble wheat arabinoxylan［J］.Enzyme and Microbial Technology，2007，41(1):103-110.

［16］ Katapodis P，Christakopoulos P.Enzymic production of feruloyl xylo-oligosaccharides from corn cobs by a family 10 xylanase from Thermoascus aurantiacus［J］.LWT，2008，41(7):1 239-1 243.

［17］ Katapodis P，Vardakou M，Kalogeris E，et al.Enzymic production of a feruloylated oligosaccharide with antioxidant activity from wheat flour arabinoxylan［J］.European Journal of Nutrition，2003，42(1):55-60.

［18］ Ralet M C，Faulds C B，Williamson G，et al.Feruloylated oligosaccharides from cell wall polysaccharides.PartⅢ:Degradation of feruloylated oligosaccharides from sugar-beet pulp and wheat bran by ferulia acid esterases from Aspergillus niger［J］.Carbohydrate Research，1994，263(2):257-269.

［19］ Szwajgier D.Content of individual phenolic acids in worts and beers and their possible contribution to the antiradical activity of beer［J］.Journal of the Tnstitute of Brewing，2009，115(3):243-252.

［20］ Niemi P，Faulds C B，Sibakov J，et al.Effect of a milling pre-treatment on the enzymatic hydrolysis of carbohydrates in brewer's spent grain［J］.Bioresource Technology，2012，116:155-160.