普洱茶優(yōu)勢菌株赭曲霉的功能和安全性研究

周才碧，陳文品，*，趙振軍，穆瑞祿，吳鐘玲，張敏星（.華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院茶葉科學系，廣東廣州5064；.長江大學園藝園林學院，湖北荊州4405；.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州5064）

普洱茶優(yōu)勢菌株赭曲霉的功能和安全性研究

周才碧1，陳文品1，*，趙振軍2，穆瑞祿1，吳鐘玲3，張敏星1
（1.華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院茶葉科學系，廣東廣州510642；2.長江大學園藝園林學院，湖北荊州434025；3.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州510642）

摘要：為了解赭曲霉在普洱茶渥堆發(fā)酵中的功能和安全性，利用普洱茶中分離、鑒定得到的赭曲霉，接種于潮水量35%的云南大葉種曬青毛茶，30℃發(fā)酵25 d制備得發(fā)酵樣，進行感官、理化和安全性分析。結(jié)果表明：與對照樣相比，發(fā)酵樣香氣濃純、湯色黑褐、滋味較平和，茶褐素、亮度、紅度和黃度等變化較為深刻，且赭曲霉毒素的含量為1.80 μg/kg，低于國內(nèi)外限量。綜上所述，赭曲霉適于普洱茶的渥堆發(fā)酵，發(fā)酵樣的安全性高。

關鍵詞：普洱茶；赭曲霉；分類鑒定；赭曲霉毒素；安全性

普洱茶是云南大葉種曬青毛茶在濕熱作用和微生物酶促作用下形成一種特種茶葉，微生物的發(fā)酵作用在云南普洱茶品質(zhì)形成中起決定性的作用，是云南普洱茶品質(zhì)形成的必要條件[1]，而赭曲霉是普洱茶渥堆發(fā)酵優(yōu)勢菌株之一。

衛(wèi)生品質(zhì)是決定普洱茶產(chǎn)品能否被安全食用、能否作為商品的基本條件，也是普洱茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的前提[2]。普洱茶具有降脂[3]、抗氧化[4]、抗過敏[5]、降血糖[6]、抗腫瘤[7]、抗病毒[8]、逆轉(zhuǎn)免疫衰老[9]等功能。但普洱茶的衛(wèi)生安全性曾遭受多次質(zhì)疑，特別是普洱茶中多種微生物毒素污染。

微生物毒素具有器官毒性、細胞毒性、分子毒性、遺傳毒性和聯(lián)合毒素，使機體產(chǎn)生免疫機能下降、生長受阻、生產(chǎn)性能減弱、抗病力降低、神經(jīng)毒性和致癌性等危害[10]，甚至中毒致死，而且一般微生物毒素的化學結(jié)構(gòu)都很穩(wěn)定，很難去除[11]。

赭曲霉毒素（Ochratoxin，OCT）是由曲霉屬[12-13]或青霉產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，包括OCTA、OCTB和OCTC等7種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中以OCTA毒性最大[14]，主要侵害動物肝臟與腎臟，抑制動物細胞有絲分裂，有致畸和致癌作用，IARC將其定為2B類致癌物。常污染糧食、花生、蔬菜、高粱[15]和咖啡豆等農(nóng)作物[16-18]，以及酵母片[19]。目前，從紅茶和普洱茶中尚未檢測到曲霉菌株產(chǎn)生的赭曲霉毒素A和伏馬毒素[20]，OCTA在50℃溫水中易浸出，且表現(xiàn)在植物間相互傳遞和感染的現(xiàn)象[21]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定，赭曲霉毒素A在谷物中的最高濃度為5 μg/kg；各國標準，規(guī)定動物飼料中赭曲霉毒素A的限量范圍在100 μg/kg～1000μg/kg之間，食品中的限量范圍為1μg/kg～50 μg/kg；中國規(guī)定谷物及其制品、豆類及其制品中赭曲霉毒素A的限量不得超過5 μg/kg[22]。

目前，國內(nèi)外對于普洱茶中赭曲霉的分離、鑒定、功能性及安全性方面的研究少見報道。在普洱茶生產(chǎn)、運輸和陳化過程，有曲霉屬菌株的參與，普洱茶中存在產(chǎn)生赭曲霉毒素的可能性，因此對普洱茶優(yōu)勢菌株赭曲霉的功能和安全性研究有特別重要的意義。

1　材料與方法

1.1儀器與材料

1.1.1儀器

AB204-N電子分析天平：上海人和科學儀器有限公司；THA-82A臺式恒溫振蕩器：江蘇金壇新一佳儀器廠；BCD-206CK冰箱：合肥美菱股份有限公司；SWCJ-2F型雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司；生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；TP600梯度PCR儀：Takara公司；Qel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)：Bio-rad公司；SHIMADZU-20AT高效液相色譜儀系統(tǒng)，包括二元高壓泵、自動進樣器、柱溫箱：日本島津公司。

1.1.2材料

陳年普洱茶，即菌株來源的材料統(tǒng)稱，包括陳升號2008年的普洱茶熟餅、恒福七子餅2009年的普洱熟茶和宜良祥龍茶廠2009普洱茶熟茶磚；云南大葉種曬青毛茶，即渥堆發(fā)酵樣的原料，為2013年的春茶（云南臨滄）；赭曲霉毒素標準品購于普瑞邦；查氏瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，自制。

1.2方法

1.2.1菌株分離和鑒定

1.2.1.1菌株分離和形態(tài)鑒定

篩選優(yōu)質(zhì)陳年普洱茶，制備10-2～10-7稀釋梯度，涂布分離培養(yǎng)菌株，純化保藏；根據(jù)初分菌落的形狀、大小、顏色和表面特征等形態(tài)特征，結(jié)合《中國真菌志》對獲得的各菌株進行初步的形態(tài)鑒定。

1.2.1.2分子鑒定

首先，采用改良CTAB法提取菌株DNA；其次，使用KOD高保真DNA polymerase進行PCR擴增目的片段，進行3730XL常規(guī)測序反應，依照ABI標準程序操作完成全序列基因；最后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，確定菌株的分類地位，構(gòu)建進化樹。

1.2.2發(fā)酵樣制備

制備107個/mL上述普洱茶中分離的優(yōu)勢菌株孢子懸浮液，接種于潮水量為35%的云南大葉種曬青毛茶中，在30℃氣候箱中培養(yǎng)25 d，取出進行45℃干燥，得到普洱茶發(fā)酵樣，不加菌株發(fā)酵樣為對照CK。

1.2.3發(fā)酵樣檢測

1）水浸出物GB/T 8305-2013《茶水浸出物測定》；

2）茶多酚GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》；

3）氨基酸GB/T 8314-2013《茶游離氨基酸總量的測定》；

4）可溶性糖-蒽酮比色法；

5）茶色素-系統(tǒng)分析法；

6）色差-色差儀；

7）pH-pH儀；

8）赭曲霉毒素NY/T 1650-2008《蘋果及山楂制品中展青霉素的測定高效液相色譜法》。

2　結(jié)果與討論

2.1赭曲霉的分離和鑒定

2.1.1形態(tài)鑒定

S7在查氏瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長很快，28℃培養(yǎng)6 d菌落達40 mm～45 mm，菌絲體白色，菌落淡黃色至淡黃褐色，菌落絲絨狀，有放射狀溝紋，無滲出液，菌落反面淡黃褐色至黃褐色；在顯微鏡下觀察，分生孢子頭球形，分生孢梗莖壁粗糙，頂囊半球形，直徑20 μm～40 μm，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，梗基（8～12）μm×（2～4）μm，分生孢子球形，直徑2.0 μm～3.5 μm。以上培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征符合赭曲霉的標準形態(tài)，菌落和孢子形態(tài)的圖1所示。

2.1.2序列分析

以真菌基因組DNA為模板，利用通用引物擴增獲得ITS基因的序列（如PCR圖）；利用NCBI中BLAST搜索，得到匹配度較高的已知序列，利用MEGA軟件進行多序列比對。結(jié)果顯示，S7基因序列與已知的Aspergillus ochraceus（GQ408916.1），相似度達到100%，與Aspergillus heteromorphus和Aspergillus nomius的相似度相對較低，系統(tǒng)進化樹結(jié)果構(gòu)建如下：

2.2赭曲霉對普洱茶發(fā)酵樣的影響

2.2.1赭曲霉發(fā)酵樣的感官品質(zhì)

微生物對于渥堆發(fā)酵型普洱茶的品質(zhì)影響，具有決定性作用。赭曲霉發(fā)酵樣的感官品質(zhì)見圖3、表1。

由圖3和表1可以看出：與CK相比，赭曲霉發(fā)酵樣附有棕、褐色菌體，香氣濃純、有特殊的蘑菇香，湯色黑褐色較渾濁，滋味較平和、無刺激性、無特殊的口感。結(jié)果表明，赭曲霉菌株107個/mL孢子懸浮液接種于潮水量35%的云南大葉種曬青毛茶中，30℃發(fā)酵25 d，菌落生長旺盛，對普洱茶影響較深刻。

2.2.2赭曲霉發(fā)酵樣的生化成分變化

赭曲霉發(fā)酵樣的生化成分變化見表2。

由表2可以看出：與CK相比，赭曲霉發(fā)酵樣水浸出物、茶多酚、可溶性糖含量呈下降趨勢，變化幅度分別為7.32%、61.25%、14.53%；氨基酸含量呈上降趨勢，變化幅度為40%。茶紅素、亮度呈下降趨勢，變化幅度為62.7%、262.86%；而茶褐素、紅度和黃度呈上升趨勢，變化幅度為623.3%、530.35%和235.57%；pH變化不明顯。

2.2.3赭曲霉發(fā)酵樣的安全性

利用HPLC測定赭曲霉發(fā)酵樣中展青霉素的含量，由表2知，赭曲霉毒素的含量為1.80 μg/kg（低于國內(nèi)外限量5 μg/kg）。結(jié)果表明，赭曲霉在潮水量35%云南大葉種曬青毛茶中，30℃發(fā)酵25 d，發(fā)酵樣赭曲霉毒素低于國內(nèi)外限量，安全性高。

3　結(jié)論

赭曲霉在查氏瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長很快，28℃培養(yǎng)6 d菌落達40 mm～45 mm，菌絲體白色，菌落淡黃色至淡黃褐色，菌落絲絨狀，有放射狀溝紋，無滲出液，菌落反面淡黃褐色至黃褐色；赭曲霉在潮水量35%云南大葉種曬青毛茶中，30℃發(fā)酵25 d，發(fā)酵樣附有棕、褐色菌體，香氣濃純、有特殊的蘑菇香，湯色黑褐色較渾濁，滋味較平和，無刺激性、無特殊的口感，茶褐素、亮度、紅度和黃度等變化較為深刻，且赭曲霉毒素低于國內(nèi)外限量，安全性高，適于普洱茶的渥堆發(fā)酵。

參考文獻：

[1]W H C,C J K,S C Y.Enhancement of fermentation process in Puerh tea by tea-leaf extract[J].Journal of Food Science,2010,75(1): 44-48

[2]陳文品,許玫.普洱茶衛(wèi)生與安全控制及相關研究現(xiàn)狀[J].食品安全質(zhì)量檢測學報,2013(5):1373-1378

[3]Cao Z H,Yang H,He Z L,et al.Effects of Aqueous Extracts of Raw Pu-erh Tea and Ripened Pu-Erh Tea on Proliferation and Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes[J].Phytotherapy Research,2013,27 (8):1193-1199

[4]Fan J P,Fan C,Dong W M,et al.Free radical scavenging and antioxidative activities of an ethanol-soluble pigment extract prepared from fermented Zijuan Pu-erh tea[J].Food and chemical toxicology: an international journal published for the British Industrial Biological Research Association,2013,59(6):527-533

[5]Yamazaki K,Yoshino K,Yagi C,et al.Inhibitory Effects of Pu-erh Tea Leaves on Mouse Type IV Allergy[J].Food and Nutrition Sciences,2012,3(3):394-400

[6]Huang Q,Chen S,Chen H,et al.Studies on the bioactivity of aqueous extract of pu-erh tea and its fractions:In vitro antioxidant activity and α-glycosidase inhibitory property,and their effect on postprandial hyperglycemia in diabetic mice[J].Food and Chemical Toxicology,2013,53(11):75-83

[7]Zhao L,Jia S,Tang W,et al.Pu-erh Tea Inhibits Tumor Cell Growth by Down-Regulating Mutant p53[J].International Journal of Molecular Sciences(Online),2011,12(11):7581-7593

[8]HUANG N,YANG L,LI X,et al.Anti-HIV activities of extracts from Pu-erh tea[J].Chinese Journal of Natural Medicines,2012,10 (5):347-352

[9]Zhang L,Shao W,Yuan L,et al.Decreasing pro-inflammatory cytokine and reversing the immunosenescence with extracts of Pu-erh tea in senescence accelerated mouse(SAM)[J].Food Chemistry, 2012,135(4):2222-2228

[10]JC V,L B,A E,et al.Electrochemical affinity biosensors for detection of mycotoxins:A review[J].Biosens Bioelectron,2013,49(2): 146-158

[11]Corcuera L A,Ibanez-Vea M,Vettorazzi A,et al.Validation of a UHPLC-FLD analytical method for the simultaneous quantification of aflatoxin B1 and ochratoxin a in rat plasma,liver and kidney[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2011,879(26):2733-2740

[12]Mata M M,Taniwaki M H,Iamanaka B T,et al.Agrobacterium-mediated insertional mutagenesis of the ochratoxigenic fungus Aspergillus westerdijkiae[J].Can J Microbiol,2007,53(1):148-151

[13]Sugita-konishi Y.Occurrence of ochratoxin A and distribution of ochratoxin A producing fungi in Japan[J].Mycotoxins,2007,57(1): 31-36

[14]Kong W,Wei R,Logrieco A F,et al.Occurrence of toxigenic fungi and determination of mycotoxins by HPLC-FLD in functional foods and spices in China markets[J].Food Chem,2014,146(1):320-326

[15]Elbashir A A,Ali S E.Aflatoxins,ochratoxins and zearalenone in sorghum and sorghum products in Sudan[J].Food Addit Contam Part B Surveill,2014,7(2):135-140

[16]Issa G A,Hassan G,Samaneh R.Ochratoxin A analysis in rice samples of different cities of Mazandaran(a province in Northern Iran) [J].Nutrition&Food Science,2014,44(3):178-183

[17]Jersek B,Poklar U N,Skrt M,et al.Effects of selected essential oils on the growth and production of ochratoxin A by Penicillium verrucosum[J].Arh Hig Rada Toksikol,2014,65(2):199-208

[18]Faucet-Marquis V,Joannis-Cassan C,Hadjeba-Medjdoub K,et al. Development of an in vitro method for the prediction of mycotoxin binding on yeast-based products:case of aflatoxin B1,zearalenone and ochratoxin A[J].Appl Microbiol Biotechnol,2014,98(17):7583-7586

[19]Faucet-Marquis V,Joannis-Cassan C,Hadjeba-Medjdoub K,et al. Development of an in vitro method for the prediction of mycotoxin binding on yeast-based products:case of aflatoxin B1,zearalenone and ochratoxin A[J].Appl Microbiol Biotechnol,2014,98(17):7583-7596

[20]Mogensen J M,Varga J,Thrane U,et al.Aspergillus acidus from Puerh tea and black tea does not produce ochratoxin A and fumonisin B2[J].Int J Food Microbiol,2009,132(2/3):141-144

[21]Iha M H,Trucksess M W.Aflatoxins and ochratoxin A in tea prepared from naturally contaminated powdered ginger[J].Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess,2010,27(8): 1142-1147

[22]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2761-2011食品安全國家標準食品中真菌毒素限量[S].北京:中國標準出版社,2011

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.042

收稿日期：2014-10-15

基金項目：國家自然科學基金項目（31270725）

作者簡介：周才碧（1986—），男（布依），研究生，研究方向：茶葉加工與安全。

*通信作者：陳文品（1971—），男，副教授，碩士生導師，研究方向：茶葉加工與安全。

Research on Function and Safety of Aspergillus ochraceus，A Preponderant Fungus during the Fermentative Process of Pu'er tea

ZHOU Cai-bi1，CHEN Wen-pin1，*，ZHAO Zhen-jun2，MU Rui-lu1，WU Zhong-ling3，ZHANG Min-xing1
（1.Department of Tea Science，College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China；2.College of Horticulture and Landscape Architecture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China；3.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou 510642，Guangdong，China）

Abstract：In order to understand the Function and Safety of Aspergillus ochraceus during the Fermentative Process of Pu'er tea，Aspergillus ochraceus separated from the Pu'er tea，was inoculated on the sun-dried green tea with 35%water，cultured 25 days with 30℃，then evaluated the sensory，security，physical and chemical of fermented sample.The research results showed that compared with CK，the contents of theabrownins，lightness，redness and brightness was changed significantly in the fermented sample with sweet thick aroma accompanied special mushroomy flavor，dark turbid liquor in chocolate-brown color，gentle taste without thrill or special，and the contents of ochratoxin was 1.80 μg/kg under the limition of home and abroad.In conclusion，Aspergillus ochraceus is one of preponderant fungus during the fermentative process of Pu'er tea，and plays a very important role to the formation of Pu'er tea quality with high safety.

Key words：Pu'er tea；Aspergillus ochraceus；identification；ochratoxin；safety