豬流行性腹瀉的實驗室診斷方法與疫苗研究進展

一、PED的實驗室診斷方法

（一）病原學診斷

1.電鏡觀察法。由于PEDV和TGEV均屬于冠狀病毒，具有相似的形狀和結構，故無法通過普通電鏡觀察進行區別，需通過免疫電鏡法（IME）進行鑒別診斷。王繼科等分別將抗原與抗體血清進行適當轉速離心，再將其混合物離心后直接在電鏡下觀察，通過觀察有無免疫復合物粒子團集結和堆積的現象從而對抗原進行鑒別區分。此方法具有簡便，快速等特點，但因為該方法所用電鏡設備價格昂貴，故在條件有限的一般實驗室和養殖場中難以適用。

2.病毒分離培養。病毒的分離培養是將疑似感染PEDV的豬只病料經過處理后接種到Vero細胞上，并在顯微鏡下觀察細胞有無病變。若接種后第2天觀察細胞出現空斑、脫落等特征，即可做出初步診斷。但這種檢測手段需結合其它手段，以保證結果可靠，另外此方法的操作程序繁雜，檢測周期長，不適用于該病的快速診斷。

（二）血清學診斷

1.微量血清中和試驗。微量血清中和試驗運用病毒與血清中存在的抗體發生特異性結合從而失去了致病力的原理，將已知抗原分別與待檢血清混合后接種到適應抗原生長的細胞上并設置對照組排除干擾，繼而通過觀察CPE進行鑒別診斷。林志雄等建立了PED微量中和試驗, 該方法將已適應傳代細胞生長的PEDV-G1株, 與被檢血清進行微量中和,接種到PK-15細胞作用48 h然后測抗體。此試驗方法操作步驟簡便、結果易于判定，適宜推廣使用。但由于測得血清中抗體不一定與防御有關，故陽性結果只能說明豬只接觸了傳染性病原微生物，所以該方法的鑒定結果有一定的不確定性。

1.免疫熒光法。免疫熒光法（IF）主要分為直接免疫熒光法（FAT）和間接免疫熒光法（IFAT），其中前者較為常用。崔現蘭等用直接免疫熒光法對發病豬的小腸切片進行檢測，結果顯示對人工方法感染PEDV的仔豬檢出率高于應用間接免疫熒光法和電鏡觀察法對PED 陽性豬血清的檢出陽性率。林志雄等用PEDV-G1株進行直接免疫熒光法測定6個豬場155份發病仔豬腸黏膜樣品，結果檢出率為52%，而且驗證其不與其它引起豬腹瀉癥狀的病原發生交叉反應，證明該方法特異性和準確性較高。

2.酶聯免疫吸附試驗（ELISA法）。ELISA法的特點在于檢測樣品的采集較為方便。在ELISA法原理的基礎上目前發展出了間接ELISA、競爭阻斷ELISA、雙抗體夾心法ELISA以及Dot-ELISA法等診斷方法。

（1）間接ELISA。國外學者Oh等將其建立的間接ELISA 法和病毒血清中和試驗進行對比，結果顯示間接ELISA 方法的特異性和敏感性均較高，表明此方法適用于PEDV的檢測。Ren等使用重組純化的M蛋白免疫家兔產生相應抗體, 建立了一種檢測PEDV的間接ELISA方法。免疫熒光分析表明抗PEDV-M抗體與PEDV感染細胞發生反應且不與其它病毒發生交叉反應，證明該方法具有良好的敏感性與特異性。

（2）競爭阻斷ELISA。此方法既可對抗原做定量的測定，也可對抗體進行檢測。國外學者Rodak L等利用制備得到的PEDV M 蛋白單抗建立了競爭阻斷ELISA診斷方法，試驗結果表明競爭阻斷ELISA具有較高的特異性和敏感性。Hou等將重組的PEDV N蛋白經大腸桿菌表達后提取，建立了一種檢測血清中PEDV抗體的ELISA方法。

（3）雙抗體夾心法ELISA。該法是檢測抗原最常用的ELISA方法之一，適用于含有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。雷利等用PEDV免疫蛋雞后收獲卵黃抗體，分離提純后得到特異性抗體，建立了酶聯免疫雙抗夾心法檢測方法。結果表明該方法具有良好的特異性和敏感性，可作為快速檢測豬流行性腹瀉病毒的一種方法。朱維正等用雙抗體ELISA 法直接檢測腹瀉病豬糞便中的抗原并將檢測結果與電鏡結果對比，其陽性符合率為97.37%，陰性符合率為100%。

（4）Dot-ELISA法。該方法是常規ELISA方法在應用中逐漸發展出來的一種改進方法。新方法使得ELISA測定的特異性和靈敏度都有所提升，使ELISA檢測操作更加簡便和快速。陳茹等通過將PEDV抗原分離純化, 建立了斑點酶聯免疫吸附試驗(Dot-ELISA)檢測PEDV抗體,與瓊脂擴散試驗的檢測結果進行對比顯示，Dot-ELISA法更為敏感,特異性強而且重復性好。

（5）商品化檢測產品。目前市場上商業化的PEDV檢測試劑盒主要分為抗體檢測試劑盒與抗原檢測試劑盒。抗體檢測試劑盒多用于非臨床試驗，如產品研發中的疫苗效果評價、某地區PEDV的流行病學檢測，養豬場引種篩選檢測等方面；抗原檢測試劑盒多用于疫病診斷，將采集的豬糞病料進行定性臨床測定。

（三）分子生物學診斷方法

1.PCR技術診斷。

（1）多重PCR。豬流行性腹瀉屬于病毒性腹瀉病, 而常見造成豬腹瀉的病毒還包括豬傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒。這三種疾病很難依靠臨床診斷進行區分，解決這個問題的常用途徑就是通過多重RTPCR技術進行診斷。張坤等分別根據PEDV M基因，TGEV N基因，GAR VP7基因的基因序列設計相應引物，建立了一種可同時檢測以上3種抗原的多重RT-PC方法；將此方法與常規RT-PCR手段進行比較后表明，該種多重RT-PCR方法敏感性和特異性均較高，是一種可行的鑒別診斷方法。

（2）熒光定量PCR。熒光定量PCR與傳統的PCR方法相比操作步驟更簡便，定量更準確且污染較小，有著很好的靈敏度和可重復性。劉鄧等在PEDV N基因序列的基礎上設計了一對特異性的引物和探針，并利用此探針建立了檢測PEDV的TaqMan熒光定量PCR方法。結果表明熒光定量PCR的陽性檢出率為92%，高于常規RT-PCR檢測結果。Kim S-H等根據豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的特異核酸序列分別設計出相應的引物和探針，建立了多重實時熒光定量PCR方法可用于PEDV和TGEV的定量檢測。

（3）巢式PCR。此方法利用兩套PCR引物（巢式引物）進行兩輪PCR擴增反應，這樣做的目的在于減少錯誤擴增片段的產生量，所以應用巢式PCR方法獲得的擴增產物特異性比較高。Ben Salem等建立了多重巢式PCR用于檢測可導致仔豬腹瀉的PEDV、TGEV和PRV-A，其中能檢測到的豬流行性腹瀉病毒的RNA濃度為27.2 μg/μl，可見巢式PCR檢測有著很高的靈敏度?；艚鹨鶕EDV M的基因序列，分別設計合成針對M基因的內、外2對特異性引物，建立了檢測PEDV的巢式RT-PCR方法，結果顯示巢式RT-PCR方法能夠快速且準確地檢測出樣本中微量的PEDV核酸。

（4）原位雜交技術。原位雜交技術用含有放射性或非放射性的外源核酸探針與樣品中的待測DNA或RNA分子進行配對，再運用相應的檢測手段顯示出雜交分子的所在位置。O Kim等用制備好的標記地高辛的核酸探針加入雜交緩沖液中，進行一系列處理后使其與組織切片中包含的PEDV相應基因發生堿基互補配對，在透射電鏡下可觀察到PEDV的遺傳物質分布。

二、豬流行性腹瀉疫苗的研究進展

1.豬流行性腹瀉組織滅活苗。1993年王明等用PEDV接種3～9日齡仔豬，然后采集發病仔豬的小腸組織和內容物，制成氫氧化鋁滅活苗；將此疫苗經后海穴注射免疫仔豬，保護率可達85%。但組織滅活苗存在生產成本高，質量控制難度大的問題。

2.豬流行性腹瀉細胞滅活苗。馬思奇等通過向病毒培養液中添加適量胰酶，使PEDV適應于Vero細胞，傳代致弱后制成氫氧化鋁滅活苗。此種方法制得的疫苗可用于PEDV疫情的預防和控制。但滅活苗存在產生免疫力需要周期長，不利于緊急預防接種的缺點。

3.豬流行性腹瀉細胞弱毒苗。佟有恩等通過對適應Vero細胞的CV777株傳至第90代進行克隆純化，得到獨立穩定和良好免疫原性的弱毒株，制成弱毒苗免疫仔豬其被動保護率達到96.2%。另外商品化的弱毒疫苗還有日本的P-5V株和韓國的KPED-9株，DR13株等，其中DR13弱毒株在韓國應用于預防豬流行性腹瀉的口服疫苗。

4.豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗。TGE-PED二聯