血清水通道蛋白4抗體測定在視神經脊髓炎疾病譜中的意義

李婷，張大啟，楊春生，翟翬

(天津醫科大學總醫院，天津 300052)

視神經脊髓炎(NMO)是視神經和脊髓同時或相繼受累的中樞神經系統脫髓鞘疾病。自2004年Lennon等［1］利用間接熒光免疫法(IIF)在NMO患者血清中發現了水通道蛋白4(AQP4)抗體以來，諸多研究表明，NMO是一類有別于多發性硬化(MS)的中樞神經系統脫髓鞘性疾病單元，并稱之為視神經脊髓炎疾病譜(NMOSD)［2］。目前在 NMOSD臨床診斷和研究中血清AQP4抗體檢測多為定性測定，而定量檢測較少。本研究利用熒光免疫沉淀(FIPA)法檢測75例中樞神經系統脫髓鞘疾病患者血清 AQP4 抗體［3～5］，并分析血清 AQP4 抗體水平與NMOSD臨床特征的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年7月～2014年8月天津醫科大學總醫院神經內科就診的75例中樞神經系統脫髓鞘疾病患者。患者的人口統計學及臨床相關信息均被收集并錄入中樞神經系統脫髓鞘疾病數據庫。NMOSD患者55例［男9例、女46例，年齡(43.1 ±1.9)歲，病程(3.6 ±0.8)年，脊髓受累節段數(5.6±0.5)個，首次發病擴展殘疾狀況評分量表(EDSS)評分(4.8 ±0.8)分，2 年內復發(1.7 ±0.1)次］，其中NMO患者13例、復發性長節段橫貫性脊髓炎(LETM)患者30例、復發性視神經炎(ON)患者12例，均符合2006年Wingerchuk等［2］修訂的NMO及其疾病譜診斷標準;MS患者20例［男6例、女14例，年齡(33.9 ±3.9)歲，病程(4.0±0.9)年，脊髓受累節段數(1.9 ±0.1)個，首次發病 EDSS評分(1.8±0.7)分，2年內復發(1.4±0.4)次］，均符合 2005 年MS 診斷標準［6］。以上疾病均由3名有豐富神經免疫疾病臨床經驗的醫師共同診斷，EDSS由已獲得EDSS評分國際資格認證的醫師評價。此外，尚有陽性對照組(PC)2例，血清由英國牛津大學臨床神經科實驗室提供;疾病對照組(OND)10例，重癥肌無力和吉蘭巴雷綜合征各5例;健康對照組(HC)10例，來源于我院健康體檢中心。

1.2 血清AQP4抗體測定 采集靜脈血，分離血清凍存于 -80 ℃。參照文獻［3～5］方法，采用 FIPA 法檢測血清AQP4抗體。EGFP標記的人AQP4 cDNA質粒和EGFP cDNA質粒由英國牛津大學臨床神經科惠贈。解凍待測組血清，4℃、10000 r/min離心5 min，取上清 5 μL 和 10 μL，分別加入 50 μL EGFPAQP4抗原提取液，混合后4℃輪轉過夜，然后加入適量非特異山羊抗人 IgG，4℃孵育2 h，10000 r/min離心3 min，棄上清，收集沉淀，最后用1 mL裂解提取緩沖液漂洗沉淀，重復3次;將沉淀移入96孔板中，在高速多通道連續波長酶標儀上獲取熒光吸光度，以健康對照組熒光均值+3倍標準差以上為陽性判斷標準，每份血清檢測均雙盲，并重復3次。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism5.0對數據進行繪圖及統計分析，相關性數據采用Spearman相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

NMOSD患者中FIPA陽性42例，NMO患者中FIPA陽性11例，LETM患者中FIPA陽性23例，ON患者中FIPA陽性8例，MS患者中FIPA陽性0例。在NMO和LETM抗體陽性患者中，AQP4抗體FU值與脊髓受累長度呈正相關(rs=0.188，P=0.012)。在血清 AQP4抗體陽性的 NMOSD患者中，AQP4抗體FU值與首次發病2年內復發次數均無相關性。4例血清AQP4抗體陽性的NMOSD患者經甲強龍沖擊、強的松和(或)硫唑嘌呤等免疫抑制劑治療后，半個月至5個月患者血清AQP4抗體逐漸轉為陰性。

3 討論

NMO是一類以體液免疫為主的中樞神經系統脫髓鞘性疾病，臨床癥狀重，病程長，致殘率高，對免疫抑制劑治療效果較好。研究［7］認為，NMO是以AQP4為靶抗原的自身免疫性疾病，對此類患者早期進行血清AQP4抗體檢測，有助于該病的早期診斷治療、復發預防及預后改善。目前國外多家神經免疫中心已建立起多種可用于檢測血清AQP4抗體敏感性、特異性均較高的臨床檢測方法。自2004年Lennon等［1］利用 IIF法在 NMO患者血清中發現AQP4抗體以來，用于檢測血清AQP4抗體的方法至少有20種，但得到廣泛認可的是日本Takahashi等［3，4］和英國 Waters等［5］為提高 AQP4 抗體檢測敏感性和特異性，率先建立的CBA法與FIPA法。其中，CBA法是在細胞表面進行觀測，為定性檢測;而FIPA法可定量測定AQP4抗體滴度。為建立可用于臨床、定性定量檢測血清AQP4抗體的方法并進一步評估AQP4抗體的臨床意義，我們利用FIPA法對75例中樞神經系統脫髓鞘疾病患者進行了血清AQP4抗體檢測，結果顯示FIPA法檢測NMOSD患者血清 AQP4抗體敏感性為 76.4%，特異性為100%，與國外 Waters等［5］報道大致相符，與 CBA相比，FIPA敏感性雖略低，但操作簡單，可進行大樣本、批量檢測。

本研究發現在AQP4抗體陽性的NMOSD患者中，AQP4抗體FU值與患者脊髓受累長度呈正相關;對4例AQP4抗體陽性的患者抗體水平進行動態觀察發現，患者在急性期甲強龍沖擊、緩解期強的松和/或硫唑嘌呤治療后，0.5～5個月患者血清AQP4抗體較為陰性。這與及Weinshenker［8］報道結果一致，提示NMOSD患者血清AQP4抗體FU值或抗體滴度水平可反映疾病是否處于急性期或再次復發，并可評估治療效果。而血清AQP4抗體FU值與首次發病2年復發率及EDSS評分無相關性，這似乎與AQP4抗體為NMO致病性抗體相悖，考慮到EDSS主要適用于MS，提示臨床需建立更適用于NMO疾病的病情評估系統。

綜上所述，血清AQP4抗體檢測可作為NMO與NVS鑒別的特異性血清學指標，血清AQP4抗體水平可判斷疾病是否復發及評估治療效果。

［1］Lennon VA，Wingerchuk DM，Kryzer TJ，et al.A serum antibody marker of neuromyelitis optica:distinction from multiple sclerosis［J］.Lancet，2004，364(9451):2106-2112.

［2］Wingerchuk DM，Lennon VA，Pittock SJ，et al.The spectrum of neuromyelitis optica［J］.Lancet Neurol，2007，6(9):805-815.

［3］Takahashi T，Fujihara K，Nakashima I，et al.Establishment of a new sensitive assay for anti-human aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica［J］.Tohoku J Exp Med，2006，210(4):307-313.

［4］Takahashi T，FUjihara K，Nakashima I，et al.Anti-aquaporin-4 antibody is involved in the pathogenesis of NMO:a study on antibody titre［J］.Brain，2007，130(Pt 5):1235-1243.

［5］Waters P，Jarius S，Vincent A，et al.Aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica and longitudinally extensive transverse myelitis［J］.Arch Neurol，2008，65(7):913-919.

［6］Milo R，Miller A.Revised diagnostic criteria of multiple sclerosis［J］.Autoimmun Rev，2014，13(4-5):518-524.

［7］Jarius S，Wildemann B.AQP4 antibodies in neuromyelitis optica:diagnostic and pathogenetic relevance［J］.Nat Rev Neurol，2010，6(7):383-392.

［8］Weinshenker BG，Wingerchuk DM，Lennon VA，et al.Neuromyelitis optica IgG predicts relapse after longitudinally extensive transverse myelitis［J］.Ann Neurol，2006，59(3):566-569.