人胃癌細胞株BGC-823克隆形態觀察及其CD44表達變化

楊宏瓊，陸亞華，周志華，張尤歷，徐岷(常州市第一人民醫院，江蘇常州00;江蘇大學附屬醫院;中國人民解放軍第0醫院)

人胃癌細胞株BGC-823克隆形態觀察及其CD44表達變化

楊宏瓊1，陸亞華1，周志華2，張尤歷3，徐岷3
(1常州市第一人民醫院，江蘇常州213003;2江蘇大學附屬醫院;3中國人民解放軍第101醫院)

摘要:目的觀察胃癌細胞株BGC-823的克隆形態，檢測干細胞標志物CD44在不同克隆形態中的表達。方法通過克隆形成實驗觀察BGC-823細胞的克隆形態并分類，計算克隆形成率及每種克隆所占比例，采用免疫熒光染色和Western blot法檢測不同克隆形態中CD44的表達情況。結果BGC-823細胞形成3種克隆形態，Holoclone、Meroclone和Paraclone型。克隆形成率為8.4%±1.1%，Holoclone型、Meroclone型和Paraclone型所占比例分別為9.8%、54.0%和36.2%。CD44在Holoclone型克隆中表達量最多。結論BGC-823細胞的克隆在形態和分化程度上存在差異，其中Holoclone型克隆可能富含胃癌干細胞。

關鍵詞:胃腫瘤;腫瘤干細胞;細胞克隆; CD44

腫瘤干細胞學說認為，腫瘤中含有少量具有自我更新能力和分化潛能、并能產生耐藥的腫瘤細胞，即腫瘤干細胞，是腫瘤發生、復發和轉移的根源［1，2］。研究發現，在體外培養條件下，多種上皮癌細胞株存在形態不同的克隆，其中具有規則致密形態的Holoclone型克隆經證實含有腫瘤干細胞［3，4］。2014年7月～2015年12月，我們觀察了胃癌細胞株BGC-823的克隆形態，并檢測干細胞標志物CD44在不同克隆形態中的表達，為研究胃癌的發生、發展機制提供依據。

1　材料與方法

1.1材料胃癌細胞株BGC-823購自中科院上海細胞生物學研究所;胎牛血清(FBS，Gibco)，胰酶(Sigma公司); Triton X100(Ameresco)，牛血清白蛋白(BSA)、DAPI(Sigma公司);克隆環(PYREX公司);兔多抗CD44、β-tubulin購自英國Abcam公司，羊抗兔二抗(辣根酶標記)、羊抗兔二抗(FITC標記)購自北京中杉金橋公司; CO2恒溫細胞培養箱(Sanyo公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國徠卡公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養將細胞接種于含10% FBS的DMEM培養液中，5% CO2、37℃培養。隔天換液1次，當細胞匯合并鋪滿培養瓶底約80%時，進行傳代培養。

1.2.2細胞克隆形態觀察采用平皿克隆形成法。取對數生長期細胞，胰酶消化，制成單細胞懸液。將細胞以500個/皿接種于直徑100mm的培養皿，共接種6個皿。靜置培養14d，動態觀察標記克隆形態并記錄細胞數。第14天顯微鏡下判斷細胞克隆形成，計算克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆數/接種細胞數×100%。棄培養基，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，Giemsa染色。參照文獻［5］將克隆分為Holoclone、Meroclone和Paraclone 3型，計算不同類型克隆的比例。

1.2.3細胞克隆CD44陽性檢測采用免疫熒光染色技術。取對數生長期細胞，消化、計數后以約300 個/皿的密度均勻接種于直徑為30mm的培養皿，共接種8個皿。靜置培養14d，隨機選擇5個皿(其他3個用于Western blot實驗)，棄培養基，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，BSA封閉。滴加一抗(CD44，1∶100)，4℃孵育過夜，PBS漂洗后滴加二抗(羊抗兔-FITC，1∶50)，37℃孵育1 h，PBS漂洗，DAPI(1∶100)染核，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察染色結果。在DAPI核定位染色藍色熒光強度相同的情況下，觀察CD44(FITC)的綠色熒光在Holoclone、Meroclone和Paraclone中的染色強度，比較不同克隆中CD44的表達強度。

1.2.4細胞克隆CD44表達量檢測采用Western blot方法。取上述培養第14天的3個培養皿，選5個Holoclone、Meroclone和Paraclone型克隆，在克隆環中消化細胞后，分別單獨接種于100mm培養皿中擴大培養，隔天換液。培養第12天，棄培養液，PBS漂洗后對3種克隆進行裂解，提取總蛋白，測蛋白濃度。

Paraclone型克隆由于細胞極少，所提蛋白量不足，將其舍棄。取BGC-823胃癌細胞蛋白作為對照。將蛋白樣品與6×Loading buffer按5∶1體積比混合，100℃水浴5min，離心后取上清。配制12%分離膠、5%濃縮膠，以50 μg蛋白上樣量進行SDS-PAGE電泳。恒流轉膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h，加一抗(兔抗人CD44，1∶1 000或β-tubulin，1∶500)，4℃孵育過夜，TBS洗膜后分別加二抗(羊抗兔HRP-IgG，1∶1 000)，37℃孵育1 h，洗膜后發光、顯影，以CD44與對應內參β-tubulin的灰度值之比作為各自的相對表達量。

1.2.5統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計量數據以珋x±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1細胞克隆生長形態及克隆形成率細胞培養第1～2天，細胞呈單個均勻分布;第3天逐漸形成克隆;第5天發現有的克隆細胞體積大，有的則較小;第7～10天，不同克隆細胞在體積、細胞排列緊密程度及細胞數各方面區別明顯;第11～14天，不同克隆區別更加明顯。倒置相差顯微鏡下可見，Holoclone型克隆形態規則，邊界平滑，細胞數目多，體積小，排列致密; Paraclone型克隆形態不規則，細胞數目少，體積大，排列松散;meroclone型克隆介于Holoclone和Paraclone型克隆之間。第14天，細胞克隆形成率為8.4%±1.1%，其中Holoclone、Meroclone和Paraclone型克隆所占比例分別為9.8%、54.0%和36.2%。

2.2細胞克隆CD44檢測結果CD44在Holoclone型克隆中呈強陽性表達，在Meroclone型克隆中的表達弱于Holoclone型克隆，在Paraclone型克隆中表達最弱。CD44在Holoclone、Meroclone型克隆和BGC-823胃癌細胞中的相對表達量分別為0.578±0.102，0.096 ±0.034，0.009±0.002，Holoclone型克隆表達量最多(P均＜0.05)。

3　討論

目前已證實，多種腫瘤中存在腫瘤干細胞，如前列腺癌［3］、胰腺癌［4］、急性白血病［5］、結腸癌［6］、神經膠質瘤［7］及乳腺癌［8］等。腫瘤干細胞可形成3種不同形態的克隆，分別稱為Holoclone、Meroclone 和Paraclone，其中Holoclone型克隆形態規則、細胞排列緊密，具有腫瘤干細胞的特性。我們的前期研究［9］也有類似的結論。

本實驗運用平皿克隆形態分離法，在胃癌細胞株BGC-823中發現了3種克隆形態，通過檢測CD44的表達情況比較不同克隆的分化特性，結果顯示CD44在Holoclone型克隆中表達最強。CD44是一種分布極為廣泛的細胞表面跨膜糖蛋白，屬于黏附分子家族，作為細胞表面組分與細胞外間質相互作用，參與細胞的遷徙運動。CD44過表達與腫瘤的浸潤、轉移、分期及耐藥等關系密切［10］。研究顯示，CD44是頭頸部鱗癌、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤干細胞的表面分子標記物［11］。Takaishi等［12］研究認為，CD44陽性胃癌細胞可能是胃癌干細胞。因此推測，Holoclone型克隆可能富含胃癌干細胞，為下一步體內外腫瘤干細胞的鑒定提供基礎與支持，對將來臨床中設計針對胃癌干細胞的靶向治療具有重要意義。

綜上所述，BGC-823細胞的克隆在形態和分化上存在差異，其中Holoclone型克隆可能富含胃癌干細胞。

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收稿日期:( 2015-01-11)

文章編號:1002-266X(2015)34-0024-02

文獻標志碼:A

中圖分類號:R735.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.009