子宮內(nèi)膜癌中TβRⅠ和TβRⅡ基因甲基化狀態(tài)

閆香庭 劉盼 藺會(huì)蘭

在世界范圍內(nèi)，子宮內(nèi)膜癌在女性腫瘤中排第七位，此病患者數(shù)量呈持續(xù)性增長(zhǎng)，其中包括年輕女性。雖然許多子宮內(nèi)膜癌表現(xiàn)為雌激素依賴(lài)性增殖，但是其致癌機(jī)制尚不清楚或尚未完全闡明。多種基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變?cè)趷盒阅[瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號(hào)傳導(dǎo)途徑便是其中之一。TGF-β調(diào)控多種基因的表達(dá)，在細(xì)胞分化、增殖和凋亡中發(fā)揮著重要作用，其受體Ⅰ、Ⅱ(TβRⅠ、Ⅱ)在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)下降或缺失。導(dǎo)致基因失活的機(jī)制主要包括基因突變和表觀遺傳學(xué)修飾，其中表觀遺傳學(xué)修飾中的啟動(dòng)子區(qū)高甲基化已被認(rèn)為是與遺傳性缺陷同等重要的分子生物學(xué)機(jī)制。本研究應(yīng)用改進(jìn)的甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MSP)，對(duì)子宮內(nèi)膜癌組織中TβRⅠ、Ⅱ兩基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)兩基因甲基化狀態(tài)與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年8月至2014年3月在我院手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本60例和癌旁正常組織60例。所取標(biāo)本均在液氮中冷凍保存。患者年齡36～69歲，平均年齡51.4歲。所取子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本經(jīng)病理確認(rèn)均為子宮內(nèi)膜樣腺癌。按FIGO(2000年)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行手術(shù)-病理分期，Ⅰ、Ⅱ期37例，Ⅲ、Ⅳ期23例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例;高、中分化49例，低分化11例。所有患者術(shù)前均未做放化療。

1.2 主要試劑 Wizard DNA純化試劑盒購(gòu)于Promega公司，亞硫酸氫鹽和對(duì)苯二酚(氫醌)購(gòu)于Sigmaaldrich公司，PCR引物購(gòu)于上海捷瑞生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TβRⅠ、TβRⅡ基因甲基化狀態(tài)的檢測(cè):采用酚/氯仿抽提法提取子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁正常組織中的DNA，將提取的DNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理，DNA單鏈中未甲基化的胞嘧啶(C)在亞硫酸鹽的作用下脫去氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)，而發(fā)生甲基化的胞嘧啶在甲基的保護(hù)下未發(fā)生任何改變。然后用Wizard DNA純化試劑盒對(duì)處理過(guò)的DNA進(jìn)行純化。

1.3.2 用甲基化特異性引物(M)和非甲基化特異性引物(U)［1，2］對(duì)所有標(biāo)本的純化 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增:TβRⅠ的非甲基化引物(5’-3’)為:CAACCCTCCAAAACTAACAACTAAACAA TGTTGGTTTTTGGTTATGTTTTATGTTTTTT，PCR反應(yīng)體系為95℃預(yù)變性12 min，95℃45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸10 min。TβRⅠ的甲基化引物(5’-3’)為:ACCCTCCGAAACTAACGACTAAACGA CGGTTTTTGGTTACGTTTTACGTTTTT，PCR反應(yīng)體系為95℃預(yù)變性12 min，95℃45 s，47℃ 45 s，72℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。TβRⅡ的非甲基化引物(5’-3’)為:TTGAAAGTTGGTTAAAGTTTTTGGA AAACAAAACCTCTCTCCACCCA，PCR反應(yīng)體系為95℃預(yù)變性12 min，95℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸 10 min。TβRⅡ的甲基化引物(5’-3’)為:GAAAGTCGGTTAAAGTTTTCGGA ACAAAACCTCTC TCCGCCCG，PCR反應(yīng)體系為95℃預(yù)變性12 min，95℃45 s，48℃ 45 s，72℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)的產(chǎn)物均進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。甲基化的陽(yáng)性對(duì)照為甲基化酶處理后的正常人外周血DNA，非甲基化的陽(yáng)性對(duì)照為正常人外周血DNA，陰性對(duì)照為雙蒸水。見(jiàn)圖1。

圖1 TβRⅠ、Ⅱ基因甲基化結(jié)果

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌及癌旁正常組織中TβRⅠ、TβRⅡ基因甲基化狀態(tài)比較 TβRⅠ在子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁正常組織的甲基化率分別為75.0%(45/60)和45.0%(27/60)，子宮內(nèi)膜癌組織的甲基化率顯著高于癌旁正常組織(χ2=11.250，P=0.001)。TβRⅡ在子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁正常組織的甲基化率分別為68.3%(41/60)和36.7%(22/60)，子宮內(nèi)膜癌組織的甲基化率顯著高于癌旁正常組織(χ2=12.063，P=0.000)。見(jiàn)表1。

表1 子宮內(nèi)膜癌及癌旁正常組織中TβRⅠ、TβRⅡ基因甲基化狀態(tài)比較 n=60，例(%)

2.2 TβRⅠ、TβRⅡ基因甲基化與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系 子宮內(nèi)膜癌組織TβRⅠ基因甲基化與臨床分期、病理分級(jí)和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。子宮內(nèi)膜癌組織TβRⅡ基因甲基化與臨床分期、病理分級(jí)和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 子宮內(nèi)膜癌中TβRⅠ、TβRⅡ基因甲基化與臨床指標(biāo)間的關(guān)系例

3 討論

隨著人們生活方式的改變和環(huán)境因素的影響，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病人數(shù)逐年增長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅著廣大女性的健康。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中涉及到基因的異常和表觀遺傳學(xué)改變，表觀遺傳學(xué)修飾最大的特點(diǎn)是它是可逆的，可以通過(guò)改變其修飾狀態(tài)來(lái)改變基因的表達(dá)。表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和基因印跡，其中基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生過(guò)程中抑癌基因失活的重要機(jī)制。DNA甲基化是指S-腺苷甲硫氨酸(SAM)中的甲基在甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下被轉(zhuǎn)移到胞嘧啶第5位碳原子上，進(jìn)而使胞嘧啶變成5-甲基胞嘧啶。甲基化的胞嘧啶通常發(fā)生在富含CpG二聯(lián)核苷的CpG島上。通常情況下CpG島位于基因的啟動(dòng)子區(qū)域。正常狀態(tài)下，啟動(dòng)子區(qū)域CpG島是不發(fā)生甲基化的，但是在某些因素作用下發(fā)生甲基化后，其下游的基因便會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄沉寂。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，許多種基因的甲基化都與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系［3－5］，而關(guān)于TGF-β受體Ⅰ、Ⅱ甲基化與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系筆者還鮮見(jiàn)有報(bào)道。

TGF-β是一種重要的多功能細(xì)胞因子，通過(guò)自分泌和旁分泌的方式調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，而這些重要作用的發(fā)揮必須通過(guò)與其細(xì)胞表面的受體結(jié)合才能實(shí)現(xiàn)。TGF-β作為配體首先與受體Ⅱ(TβRⅡ)相結(jié)合，結(jié)合后形成的復(fù)合物使TGF-β發(fā)生構(gòu)象的改變，因而被受體Ⅰ(TβRⅠ)所識(shí)別，進(jìn)而形成TGF-β-TβRⅡ-TβRⅠ復(fù)合體，活化的TβRⅡ可發(fā)揮絲氨酸/蘇氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶的作用激活TβRⅠ，活化的TβRⅠ可以將信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常在多種腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起到了關(guān)鍵性作用，TGF-β本身就是一種抵抗細(xì)胞增殖的因素，但是在一些腫瘤組織中其抑制作用顯得尤其微弱，這與腫瘤細(xì)胞上的TGF-β受體表達(dá)量減少或缺失有很大關(guān)系。有研究指出，與癌旁正常組織相比，食管鱗狀細(xì)胞癌中TβRⅠ、TβRⅡ兩基因的mRNA表達(dá)均明顯降低，說(shuō)明其表達(dá)下降與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系［6］。袁明等［7］用免疫組化的方法對(duì)正常胃黏膜、腸化生、不典型增生及胃癌中TβRⅠ、Ⅱ基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩基因的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)。Borczuk等［8］研究發(fā)現(xiàn)，TβRⅡ表達(dá)抑制是肺腺癌進(jìn)展的重要原因，缺失此基因的肺腺癌小鼠淋巴結(jié)高度轉(zhuǎn)移，其存活率也明顯下降。

研究證明，TβRⅠ、Ⅱ在腫瘤組織中表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)或缺失［9，10］，這可能與基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化有關(guān)。Guo等［11］研究發(fā)現(xiàn)，TβRⅠ、TβRⅡ兩基因在賁門(mén)腺癌中的甲基化率明顯高于相應(yīng)的正常組織，而且其高甲基化率與mRNA和蛋白的表達(dá)下降或缺失有關(guān)。Dong等［12］對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的研究也發(fā)現(xiàn)，TβRⅠ、TβRⅡ基因高甲基化與其mRNA和蛋白的表達(dá)減少相關(guān)。Chen等［13］發(fā)現(xiàn)，B 細(xì)胞淋巴瘤中的 TβRⅡ基因表達(dá)缺失可以用5-氮雜胞苷逆轉(zhuǎn)，這表明啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能是引起基因沉默的原因。另外，也有研究顯示，在高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性結(jié)直腸癌中TβRⅡ的基因突變與CpG島高甲基化表型有直接關(guān)系［14］。

以上研究結(jié)果與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)TβRⅠ在子宮內(nèi)膜癌組和癌旁正常組的甲基化率分別為75.0%(45/60)和 45.0%(27/60)，子宮內(nèi)膜癌組的甲基化率顯著高于癌旁正常組;TβRⅡ在子宮內(nèi)膜癌組和癌旁正常組的甲基化率分別為68.3%(41/60)和36.7%(22/60)，子宮內(nèi)膜癌組的甲基化率亦顯著高于癌旁正常組，以上結(jié)果提示這兩種基因的甲基化與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)。但是我們對(duì)子宮內(nèi)膜癌按病理分級(jí)，臨床分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組比較后，發(fā)現(xiàn)這兩種基因的甲基化與這些指標(biāo)并無(wú)相關(guān)性，這提示TβRⅠ、TβRⅡ基因甲基化可能不是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌發(fā)展轉(zhuǎn)移的因素。

此外，尚存在一些結(jié)果不同的研究。Hinshelwood等［15］對(duì)乳腺癌細(xì)胞株研究后發(fā)現(xiàn)，TβRⅠ、TβRⅡ基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化不是導(dǎo)致其表達(dá)受到抑制的原因。Yamashita等［16］研究指出，在鼠前列腺癌細(xì)胞株中存在TβRⅡ啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，而在人前列腺癌組織中不存在此基因啟動(dòng)子的甲基化。還有研究對(duì)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)TβRⅠ在31.4%的肺癌組織中表達(dá)降低或缺失，推測(cè)此現(xiàn)象是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因之一。但是在此基因的啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)現(xiàn)基因甲基化，這提示TβRⅠ的表達(dá)缺失或降低可能與啟動(dòng)子甲基化無(wú)關(guān)［17］。

我們分析導(dǎo)致其結(jié)果有差異的原因主要與腫瘤異質(zhì)性有關(guān)，各種類(lèi)型的腫瘤其發(fā)生甲基化的基因及甲基化狀態(tài)都是存在差異的。另外，各研究所選的甲基化位點(diǎn)有差異，這也是造成結(jié)論不同的原因之一。

分析基因的甲基化狀態(tài)在腫瘤的早期診斷方面有極其重要的意義，一些基因的甲基化表現(xiàn)為腫瘤特異性，同時(shí)一些腫瘤擁有特異的甲基化基因。有研究已經(jīng)證明可以從結(jié)直腸癌患者的糞便中，肺癌患者的痰液中，腎癌、膀胱癌患者的尿液中檢測(cè)出基因的甲基化狀態(tài)［14］。同樣，可以取子宮內(nèi)膜癌患者的分泌物進(jìn)行甲基化分析，對(duì)脫落細(xì)胞的檢測(cè)可以對(duì)實(shí)體腫瘤的早期診斷做到無(wú)創(chuàng)處理，與傳統(tǒng)的診斷性刮宮相比，很大程度地降低了醫(yī)源性創(chuàng)傷。另外，檢測(cè)血液中基因的甲基化狀態(tài)也是未來(lái)的發(fā)展方向之一。基因甲基化先于細(xì)胞的惡性增生，因此對(duì)甲基化的檢測(cè)可以早期預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)生，并進(jìn)行有效的干預(yù)。基因的甲基化狀態(tài)是一種可逆的表觀遺傳學(xué)改變，5-氮雜胞苷作為一種甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可以逆轉(zhuǎn)基因CpG島的甲基化狀態(tài)，從而恢復(fù)基因的表達(dá)活性。應(yīng)用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑重新激活抑癌基因的活性，可能會(huì)成為晚期腫瘤患者的潛在治療選擇。

我們對(duì)子宮內(nèi)膜癌中TβRⅠ、TβRⅡ基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)進(jìn)行的研究，可以提供新的基因靶向治療位點(diǎn)，并為子宮內(nèi)膜癌的早期診斷治療提供一種分子指標(biāo)。隨著對(duì)表觀遺傳學(xué)的深入研究，不久的將來(lái)，腫瘤的表觀遺傳學(xué)治療將成為腫瘤綜合治療的主要組成部分，并且會(huì)在降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要的作用。

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