膽囊收縮素-8對大鼠急性腦損傷后核因子-κB活性的影響

邵恩得 張靜軒 田世文 張萬興 王恒 扈玉華

核因子-κB(NF-κB)是炎性反應調節過程中的重要轉錄因子，其活化后可激起TNF-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和 IL-1(interleukin-1，IL-1)等一些促炎性因子的大量表達，從而促進了一系列的炎性反應的發生。在顱腦創傷的過程中炎性因子的過度表達加重了神經元細胞的損害［1］。CCK是一種存在于胃腸道及中樞神經系統的腦腸肽，CCK-8在炎性反應過程有明顯抑制作用。本研究通過觀察大鼠顱腦外傷后NF-κB的表達以及 CCK-8對其表達的影響，探討CCK-8的腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與動物分組 NF-κB凝膠遷移檢測分析(EMSA)試劑盒購于美國 Promega公司，γ32P-ATP購于北京亞輝生物公司。取成年雄性Wistar大鼠60只(動物合格證號:703017)，體重280～300 g，由河北醫科大學動物實驗中心提供，隨機分為對照組(n=12)、創傷組(n=24)、CCK-8 組(n=24)，創傷組及CCK-8組又平均分為術后12 h、24 h及72 h。

1.2 動物模型制作 采用液壓打擊致傷法制作大鼠腦外傷模型。CCK-8組于實驗前40 min，經大鼠尾靜脈注射 CCK-8，40 μg/kg，每只 0.2 ml;創傷組在致傷前30 min注射等量0.9%氯化鈉溶液;對組大鼠只行顱骨開窗，不做液壓打擊。各組實驗動物根據不同時間點處死，取腦組織挫傷灶前緣2～3 mm處腦皮質標本，分別行采用免疫組化及電泳遷移率改變分析的方法，觀察NF-κB核內外的活性情況，并檢測挫傷周圍腦水腫情況。

1.3 腦組織 NF-κB活性測定 腦組織核蛋白10 μg，γ32P 標記的 DNA 探針 2 μl，加入緩沖液至 10 μl，在室溫下進行結合反應30 min，電泳電壓為100 V，時間為2 h，將明膠放入-70℃冰箱中顯影，應用圖像分析系統進行光密度分析。

1.4 腦組織含水量測定 取創傷傷緣3 mm處腦皮質，大小約100 mm3，電子天平稱濕重，置真空恒溫干燥箱，將溫度設置100℃烘烤24 h，稱干重，根據腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%，計算腦組織含水量。

1.5 NF-κB的表達 取創傷灶邊緣4 mm×4 mm×4 mm的腦組織固定、包埋制作蠟塊。免疫組化使用ABC-ELISA方法，DAB鏡下顯色，顯微鏡下細胞內出現棕黃色顆粒為陽性結果。每只大鼠隨機抽取4張切片，在高倍鏡下隨機取5個視野，計錄陽性細胞，取平均陽性細胞數。

1.6 統計學分析 應用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦組織NF-κB活性 對照組各時間點NF-κB的活性無明顯變化(P＞0.05)，創傷組大鼠在腦損傷后12 h NF-κB活性開始增高，傷后24 h達高峰，與對照組相比各時間點NF-κB的活性均明顯增加(P＜0.05)。CCK-8組與創傷組比較各時間點NF-κB的活性顯著下降(P＜0.05)。說明CCK-8對細胞核內NF-κB的DNA結合活性有明顯抑制作用。見表1，圖1。

表1 腦組織NF-κB活性比較 ±s

表1 腦組織NF-κB活性比較 ±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與創傷組比較，#P ＜0.05

組別 傷后12 h 傷后24 h 傷后72 h對照組(n=12)19.81±5.02 17.16±4.21 18.54±4.01創傷組(n=24) 97.56±4.65* 143.54±8.41* 106.66±7.54*CCK-8組(n=24) 68.76±5.54*# 83.43±5.01*# 71.42±4.43*#

圖1 NF-κB的DNA結合活性

2.2 腦組織含水量 創傷后各時間點，創傷組大鼠腦組織含水量均高于對照組(P＜0.05)，24 h達高峰，72 h仍持續較高水平，CCK-8組大鼠腦含水量與對照組相比各時間點有所增高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，但CCK-8組大鼠腦含水量與創傷組相比各時間點明顯降低(P＜0.05)。見表2。

表2 腦含水量比較%，±s

表2 腦含水量比較%，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與創傷組比較，#P ＜0.05

組別 傷后12 h 傷后24 h 傷后72 h對照組(n=12)16.48±2.68 18.02±2.60 16.87±3.01創傷組(n=24) 71.23±5.36* 90.65±5.44* 82.00±2.43*CCK-8組(n=24) 44.76±5.40*# 70.35±4.56*# 66.43±4.09*#

2.3 免疫組織化學 對照組大鼠腦組織神經元細胞NF-κB無陽性表達。創傷組大鼠各時間點均有陽性表達，在損傷24 h達到高峰，之后略有所下降，顯微鏡下觀察NF-κB主要在神經元細胞及神經膠質細胞內表達，為棕黃色小顆粒，如表3所示。CCK-8組與創傷組比較各時間點NF-κB的表達均顯著減少(P＜0.05)。見表3，圖2。

表3 NF-κB陽性表達個，±s

表3 NF-κB陽性表達個，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與創傷組比較，#P ＜0.05

組別 傷后12 h 傷后24 h 傷后72 h對照組(n=12)2.34±0.79 2.25±0.21 2.04±0.40創傷組(n=24) 28.59±3.06* 38.00±1.76* 29.44±4.12*CCK-8組(n=24) 6.31±1.61*# 7.34±3.00*# 5.22±1.07*#

圖2 NF-κB的免疫組化染色

3 討論

NF-κB是一種多效性的轉錄因子，它與多種啟動因子的κB序列結合從促進其表達，與炎性反應、免疫應答及細胞的增生、轉化和凋亡等一系列的病理生理過程密切關聯［2］。NF-κB的激活對細胞因子及趨化因子組織的免疫應答尤為重要，腦組織損傷后細胞內TNF-α、IL-1、IL-6等因子的表達急劇增加，而這些因子的激活均依賴于NF-κB的活化［3］。在炎性反應啟動后，生成的TNF-α、IL-1同時又是 NF-κB 的激活物，從而使炎性反應成瀑布式級聯放大，所以NF-κB激活在指導炎性起始過程中發揮了重要作用，在顱腦創傷過程中，NF-κB的過度表達通過啟動炎性反應加重了二次損傷［4］。

本研究發現，創傷組大鼠在顱腦創傷后12 h NF-κB陽性細胞明顯增加，24 h達高峰，一直持續到72 h，陽性細胞主要為膠質細胞，對照組腦組織無陽性細胞表達。創傷組大鼠在傷后12 h腦水腫開始出現，24 h達最高峰，72 h水腫仍較明顯。NF-κB的活性檢測顯示其表達規律與免疫組化研究結果及腦水腫的發生在時間上具有明顯的一致性，波峰重合，這一現象說明，NF-κB的表達啟動了級聯擴大的炎性反應，在顱腦的創傷的繼發性損傷過程中起到了至關重要的作用。

膽囊收縮素是一種氨基酸多肽，它既具有一般胃腸激素的作用，還可以神經遞質的形式在中樞神經系統發揮作用。叢斌等［5］在實驗中發現CCK-8有抑制NF-κB的活性的作用。扈玉華等［6］首次將 CCK-8應用于脊髓損傷實驗大鼠后發現NF-κB的表達明顯受到抑制，有效的減輕了脊髓損傷后的二次損傷，給CCK-8應用于中樞神經系統損傷的保護作用提供了有力的理論依據。本實驗發現，CCK-8組大鼠NF-κB活性較創傷組顯著減少(P＜0.05)，這一結果與各時間點NF-κB的表達及腦水腫結果相一致。由此我們可以得出CCK-8可通抑制NF-κB活化，從而阻止了炎性反應的起始環節，極大減輕了受損神經組織的繼發性損傷。

CCK-8通過抑制NF-κB活化在顱腦外傷中的腦保護機制還在進一步的研究中，其主要作用機制是阻斷NF-κB的上游激活系統，如抗氧化作用及抑制IκB的降解，氧化應激作用是使NF-κB激活的一個重要途徑，目前已知CCK-8可促進超氧化物酶歧化酶的活性，從而加強抗氧化作用［7］，這樣就一定程度上間接的抑制了NF-κB的激活。NF-κB分子之所以能穩定的存在于胞漿中是因為有NF-κB抑制劑IκB的存在，這樣NF-κB就不能進入胞核而穩定的在胞質中存在，而CCK-8可以通過 p38 MAPK、cAMP-PKA及 DAGPKC信號通路抑制IκB蛋白降解，從而加強了對NF-κB 激活的抑制作用［8-10］。

此外，CCK-8還可從通過抑制TNF-a的表達，從而減弱其與NF-κB形成的正反饋激活系統，通過在中間環節的抑制作用而減輕繼發炎性反應，破壞級聯式的炎性反應系統［11］。

1 Jung KJ，Go Ek，Kim JY，et al.Suppression of age-related renal changes in NF-κB and its target gene expression by dietary ferulate.J Nutr Biochem，2009，20:378-388.

2 Jian W，Sylvain D.Inflammation after intracerebral hemorrhage.J Cereb Blood Flow Metab，2007，27:894-908.

3 Bergqvist S，Ghosh G，Komives E.The IkappaBalpha/NF-kappaB complex has two hot spots，one at either end of the interface.Protein Sci，2008，17:2051-2058.

4 Wu H，Cong Y，Wang D，et al.Correlation of macrophage inflammatory protein-2 expression and brain edema in rats after intracerebral hemorrhage.Int J Clin Exp Pathol，2009，2:83-90.

5 叢斌，凌亦凌，谷振勇，等.八肽膽囊收縮素對脂多糖誘導大鼠肺組織NF-κB活性增高的抑制作用.中國病理生理雜志，2002，18:615-618.

6 扈玉華，張慶俊，叢斌，等.膽囊收縮素-8對大鼠急性脊髓損傷核因子-κB活性的影響.中華物理醫學與康復雜志，2001，23:345-347.

7 葉欣，萬曙，詹仁雅.NF-κB信號通路和腦出血后的繼發性腦損傷.國際神經病學神經外科雜志，2010，37:171-174.

8 Jung KJ，Go Ek，Kim JY，et al.Suppression of age-related renal changes in NF-κB and its target gene expression by dietary ferulate.J Nutr Biochem，2009，20:378-388.

9 MA Jie，DONG Zhi.Neuroprotective effect of propofol:a study progress.Int J Pharm Res，2008，35:92.

10 Hsieh H，Wu C，Yang C.Bradykinin induces matrix metal-loproteinase-9 expression and cell migration through a PKC-dependent ERK/Elk-1 pathway in astrocytes.Glia，2008，56:619-632.

11 孟愛宏，凌亦凌，張霄鵬.p38 MAPK和STAT3參與CCK-8抑制LPS誘導的大鼠促炎癥細胞因子生成.中國病理生理雜志，2013，12:1095-1101.