miR-26a在卵巢癌患者血清中的表達及其臨床意義

陜西省腫瘤醫院(西安710061)

周　敏　崔曉娜 　趙西俠 　王　勤

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miR-26a在卵巢癌患者血清中的表達及其臨床意義

陜西省腫瘤醫院(西安710061)

周敏崔曉娜 趙西俠 王勤

目的:探討卵巢癌患者血清miR-26a的表達情況及其在卵巢癌診斷及預后的價值。方法:收集70例卵巢癌患者及健康婦女的血清標本,提取血清總RNA,通過實時定量PCR檢測血清miR-26a的表達水平,繪制ROC曲線；并分析miR-26a的表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系,以及miR-26a的表達與病人的生存之間的關系。結果:卵巢癌患者血清中miR-26a表達高于健康對照組,ROC 曲線下面積0.7963,最大約登指數0.729,靈敏度84.3%,特異度88.6%,對應診斷界值3.07。卵巢癌患者血清miR-26a表達與卵巢癌的臨床分期、細胞核分化程度呈正相關,而與年齡及組織學類型無顯著相關性。血清miR-26a高表達的卵巢癌患者5年生存率要低于血清miR-26a低表達患者。結論:卵巢癌患者血清中miR-26a表達水平增高,為卵巢癌的臨床診斷及預后判斷提供了重要參考。

卵巢癌由于缺少有效的篩查手段,確診時70%以上已是晚期,病死率居婦科惡性腫瘤的首位,5年生存率低于30%。miRNA是一組存在于真核生物中的長度約21～23個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA,通過降解靶mRNA或抑制其翻譯,從而調控基因的表達,調節細胞生長、組織分化等,因而與發育、疾病有關[1]。研究表明：miRNA同腫瘤的發生、發展密切相關[2]，miR-26a在多種惡性腫瘤中異常表達,并與腫瘤細胞的增殖、侵襲遷移等有關[3]。Shen等[4]研究證明MiR-26a促進卵巢癌的增殖及腫瘤的形成。Chung[5]通過miRNA芯片分析了2例卵巢癌患者于健康對照的miRNA血清表達譜,發現miR-26a表達上調,被認為是候選的卵巢癌新的生物標志物。本研究利用RT-qPCR 技術檢測卵巢癌患者血清miR-26a的表達并進一步分析其表達意義。

資料與方法

1 一般資料觀察組70例為陜西省腫瘤醫院2011年7月至2014年7月收治的卵巢癌患者；對照組70例為同期健康體檢者。觀察組均符合納入標準:①患者均經影像學和病理組織學確診為卵巢癌,均為初診初治患者；②均未接受放、化療及激素等藥物治療； ③肝腎功能未見異常；④無其他腫瘤及內科疾病。年齡30～75歲,平均60.14±5.33歲；絕經56例,未絕經14例；臨床分期: 早期21 例,中期33 例,晚期13 例。對照組70例健康婦女中,年齡28～76歲,平均58.14±8.57歲；絕經53例,未絕經17例。兩組受試者在年齡、生理等方面比較無顯著性差異(P<0.05),具有可比性。

2 檢測方法

2.1標本收集：空腹采血5 ml,真空干燥管中保存,2000r/min 離心10 min 后,-80℃冰箱保存待測。

2.2試劑與主要儀器：miR-26a和內參U6引物購自上海吉瑪技術服務公司,Trizol試劑由美國Invitrogen公司提供,miRcute miRNA提取分離試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,miRNA反轉錄引物和反轉錄試劑購自Ambion 公司,SYBR Premix購自TaKaRa公司；主要儀器: 美國ABI公司7500實時定量PCR儀；-80℃冰箱(Thermo)；美國Beckman臺式低溫高速離心機。

2.3miR-26a的提取及反轉錄:按照北京天根生化科技有限公司的miRcute miRNA提取分離試劑盒所述步驟提取miRNA。紫外分光儀檢測RNA濃度及純度。應用美國Ambion 公司的特異性miRNA反轉錄引物并按照反轉錄試劑盒步驟合成cDNA,每個反轉錄體系中含有10 ng 的RNA模板。反轉錄的條件: 16℃ 30 min, 42℃ 30 min, 85℃ 5 min。

2.4RT-qPCR 反應條件：95℃ 15s,95℃ 10s,60℃ 30s,40個循環。采用的相對定量法計算miR-26a的相對表達量( F ),F = 2-Δct,Δct =ctmiR-26a-ctU6,其中ct為每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。

結　果

1血清miR-26a 的表達水平比較 通過RT-qPCR檢測卵巢癌患者血清及健康對照血清中miR-26a 的表達情況,結果顯示卵巢癌患者血清中miR-26a的表達水平高于健康對照組(P<0.01)。

2血清miR-26a表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系血清miR-26a表達水平與臨床分期密切相關,隨著臨床進展,血清miR-26a的表達逐漸升高(P<0.05)。此外,血清miR-26a表達與卵巢癌細胞核分化程度亦密切相關,血清miR-26a在卵巢癌細胞核中/低分化組的表達顯著高于細胞核高分化組(P<0.05)。miR-26a的表達與卵巢癌其他臨床病理特征,包括年齡、組織學類型均無顯著相關性(P>0.05)。

3血清miR-26a表達水平對卵巢癌的診斷效率根據上述血清miR-26a的表達水平繪制ROC曲線。結果顯示：ROC曲線下面積0.7963,最大約登指數0.729,靈敏度84.3%,特異度88.6%,對應診斷界值3.07。

4血清miR-26a表達與卵巢癌患者生存之間的關系血清miR-26a表達與卵巢癌患者術后5年生存率密切相關,miR-26a高表達的卵巢癌患者術后5年生存率顯著低于miR-26a低表達的患者(Log-rank test:P=0.0412)。

討　論

腫瘤標志物是反映腫瘤存在或者進展的化學類物質,或不存在于正常成人組織而僅見于胚胎組織,或在腫瘤組織中的含量大大超過在正常組織里的含量。腫瘤標志物的存在或量變可以提示腫瘤的性質,借以了解腫瘤的組織發生、細胞分化、細胞功能,以幫助腫瘤的診斷、分類、預后判斷以及治療指導。理想的腫瘤標志物的特點：①敏感性高,能早期檢測出腫瘤患者；②特異性好,能準確鑒別腫瘤/非腫瘤患者；有器官特異性,方便對腫瘤的定位；③血清中水平與腫瘤體積大小、臨床分期相關,用以判斷預后；④半衰期短,可反映腫瘤的動態變化,監測治療效果、復發和轉移測定方法精密度、準確性高,操作方便。

研究證明,miRNAs與腫瘤的發生發展有著極為密切的關系,利用芯片等高通量檢測技術發現其在腫瘤組織與正常組織之間存在顯著差異,并且具有明顯的組織特異性,更重要的是miRNAs可以在人體的血清、血漿等體液中檢測出來,為開展無創診斷帶來了可能[6]。Chai等[7]發現在肝細胞癌中miR-26a通過PI3K/Akt通路下調巨噬細胞集落刺激因子的表達抑制巨噬細胞的招募。在乳腺癌中miR-26a通過靶向作用于HMGA1分子抑制腫瘤細胞的增殖。在膽管癌細胞中ω-3多不飽和脂肪酸通過抑制miR-26a/b的表達上調15-PGDH表達,為ω-3多不飽和脂肪酸治療膽管癌提供了前期研究基礎[8]。miR-26a在多種惡性腫瘤中異常表達,并與腫瘤細胞的增殖、侵襲遷移等有關[4]。如上所述,MiR-26a促進卵巢癌的增殖及腫瘤的形成[5]。與健康對照的miRNA血清相比,卵巢癌患者血清miR-26a表達上調,被認為是候選的卵巢癌新的生物標志物[6]。

我們的研究證實了卵巢癌患者血清中miR-26a表達高于健康對照組,ROC 曲線下面積0.7963,最大約登指數0.729,靈敏度84.3%,特異度88.6%,對應診斷界值3.07,提示血清中miR-26a可以作為卵巢癌診斷的分子指標；卵巢癌患者血清miR-26a表達與卵巢癌的臨床分期、病理分級呈正相關,而與年齡無顯著相關性；血清中miR-26a高表達的患者5年生存率要低于血清中miR-26a低表達患者。我們的研究為卵巢癌的臨床診斷及預后判斷提供了重要參考,具有重要的臨床應用價值。

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(收稿：2015-06-20)

R737.31

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.073

主題詞卵巢腫瘤/診斷卵巢腫瘤/病理學預后@ miR-26a