會(huì)澤縣仔豬黃白痢大腸桿菌的分離與鑒定及耐藥性實(shí)驗(yàn)

張世永嚴(yán)玉霖王文梅呂忠芬

(1.會(huì)澤縣寶云街道畜牧獸醫(yī)站,云南曲靖654200;2.云南省農(nóng)業(yè)大學(xué),云南昆明650201; 3.會(huì)澤縣娜姑鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,云南曲靖654200; 4.會(huì)澤縣畜牧局技術(shù)服務(wù)中心,云南曲靖654200)

會(huì)澤縣仔豬黃白痢大腸桿菌的分離與鑒定及耐藥性實(shí)驗(yàn)

張世永1嚴(yán)玉霖2王文梅3呂忠芬4

(1.會(huì)澤縣寶云街道畜牧獸醫(yī)站,云南曲靖654200;2.云南省農(nóng)業(yè)大學(xué),云南昆明650201; 3.會(huì)澤縣娜姑鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,云南曲靖654200; 4.會(huì)澤縣畜牧局技術(shù)服務(wù)中心,云南曲靖654200)

分析會(huì)澤當(dāng)?shù)刈胸i大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感度,為臨床中大腸桿菌病的防治提供理論依據(jù);了解會(huì)澤縣仔豬黃白痢大腸桿菌是否存在及其流行情況;為深入研究仔豬大腸桿菌的耐藥機(jī)制及其致病機(jī)制奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。會(huì)澤縣關(guān)于仔豬大腸桿菌病流行情況,目前未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道,本研究的開(kāi)展能為會(huì)澤縣動(dòng)物性大腸桿菌病的研究提供相關(guān)資料。

大腸桿菌;致病性;血清型;耐藥性;超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

1 會(huì)澤縣仔豬黃白痢流行情況

目前，會(huì)澤縣境內(nèi)21個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）大部分規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶均不同程度存在仔豬黃白痢的流行，但規(guī)模化豬場(chǎng)由于對(duì)豬只的飼養(yǎng)管理更加合理化，致使其發(fā)病率相對(duì)較低。經(jīng)本人調(diào)查，使用仔豬黃白痢相關(guān)疫苗進(jìn)行免疫的豬場(chǎng)，仔豬黃白痢的發(fā)生幾率較低，同時(shí)即便有少量豬只發(fā)病使用常規(guī)的抗生素類藥品均能有較好療效；不使用疫苗的豬場(chǎng)一旦發(fā)病，在使用抗生素時(shí)往往療效較差或需要使用大量藥物才能控制疫病的發(fā)展。

在疫苗使用方面大部分規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)均選用三價(jià)基因工程苗；在藥物選擇方面則主要包括口服類（氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氧氟沙星、強(qiáng)力霉素、阿莫西林、鹽酸洛氟沙星及某些中藥或中成藥等）、注射類（磺胺芐甲氧嘧啶）及外用類（氯氟平）。

2 采樣方法

依據(jù)仔豬黃白痢的臨床特征，選擇10日齡內(nèi)表現(xiàn)精神沉郁，腹瀉，排出淡黃色、乳白色或灰綠色糊狀糞便的仔豬，以窩為單位采集糞便，編號(hào)后作為試驗(yàn)原料。

3 試驗(yàn)方法

3.1 會(huì)澤縣仔豬黃白痢大腸桿菌的分離

采集會(huì)澤縣部分規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶疑似仔豬黃白痢糞便，從單份糞便中挑取約0.5g樣品用10ml滅菌生理鹽水稀釋后，離心機(jī)內(nèi)離心取上清液約0.5g，以滅菌棉簽捈布于麥康凱培養(yǎng)基，置溫箱內(nèi)培養(yǎng)37℃24h后；挑選單個(gè)粉紅菌落再次分別接種于麥康凱培養(yǎng)基及伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，置溫箱內(nèi)培養(yǎng)37℃24h后，觀察記錄并保存結(jié)果。

3.2 形態(tài)學(xué)鑒定

將上述分離培養(yǎng)所得菌株，以革蘭氏染色法染色后，在顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

3.3 生化鑒定

將經(jīng)純化培養(yǎng)后菌種接種到葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、尿素、硫化氫、明膠、蔗糖、v-p及蛋白胨微量試劑管中，置37℃24h后，觀察并記錄結(jié)果；

3.4 菌株的保存

將所需保存菌株的肉湯培養(yǎng)物取適量置于密閉試管內(nèi)，加入終濃度為30%的甘油生理鹽水，置-20℃冰箱保存，保存半年后重新轉(zhuǎn)種。

4 結(jié)果

由相關(guān)結(jié)果得出，大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上呈微紅色菌落，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。

由相關(guān)結(jié)果得出，大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上呈深紫黑色、光滑、濕潤(rùn)、帶有金屬光澤的圓形菌落。

本次試驗(yàn)共采集到疑似仔豬黃白痢糞便40份，分離培養(yǎng)得到疑似大腸桿菌（在麥康凱瓊脂平板上呈微紅色菌落，在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上呈黑色帶金屬光澤菌落）共35份。

5 討論

5.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

在2012年7月至2013年5月期間，從會(huì)澤縣內(nèi)8個(gè)豬場(chǎng)共采集到特征性仔豬黃白痢糞便樣本40份，仔豬品種包括蘇太、洋三元、PIC、約長(zhǎng)撒、杜約共5個(gè)品種，利用麥康凱和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，共分離到疑似大腸桿菌菌株35份，這說(shuō)明從具備仔豬大腸桿菌病典型臨床表現(xiàn)的病仔豬糞便中能分離培養(yǎng)到的菌種可能有很多種，臨床上如需確認(rèn)仔豬病原類型，必須采樣后送相關(guān)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

5.2 形態(tài)學(xué)及生化鑒定

此次所分離的40份菌株，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢后的35份菌株，生化鑒定與形態(tài)鑒定結(jié)果表現(xiàn)一致，分離率為87.5%。

5.3 具有較強(qiáng)的致病性

4株產(chǎn)ESBLS菌株，對(duì)小白鼠的致病率均為100%，但在相同濃度條件下，同菌株不同個(gè)體小白鼠的死亡時(shí)間不同，不同菌株不同個(gè)體小白鼠的死亡時(shí)間也不同。并且由于4份菌株中有1株無(wú)血清型鑒定結(jié)果作為參考依據(jù)，故實(shí)際的致病性大腸桿菌的感染率可能更高。

國(guó)內(nèi)外近幾年的研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)能致病的大腸桿菌血清型越來(lái)越多，在防治本病的過(guò)程中應(yīng)充分考慮疫苗及藥品的選擇，以達(dá)到最好的免疫及治療效果。

5.4 對(duì)常用藥物具有廣泛耐受性

此次分離培養(yǎng)的菌株對(duì)除頭孢噻肟（耐藥率17.5%）、頭孢他啶（耐藥率2.5%）及多粘菌素（耐藥率2.5%）外的其他強(qiáng)力霉素等7種常用藥物（耐藥率均＞50%）有廣泛的耐受性，其中氨芐西林和阿莫西林的耐藥率甚至＞80%，這可能和本地區(qū)臨床過(guò)多使用這兩類藥物有關(guān)。此外此次測(cè)定的40份菌株中，單一菌株對(duì)抗生素耐受性表現(xiàn)為最少的耐受2種藥品，最多的耐受7種藥品，并且耐受藥物的種類有的相同有的不同，這可能和本豬場(chǎng)使用藥品的種類及菌株自身血清型有關(guān)。

抗菌藥不僅能預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，有些甚至還能起到很好的促生長(zhǎng)作用，這使得養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展離不開(kāi)抗菌藥物。因此，長(zhǎng)期使用抗菌素和濫用抗生素是藥物殘留及細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的源頭，兩者相互依賴而存在，使細(xì)菌耐藥性的危害越來(lái)越嚴(yán)重。

因此建議，應(yīng)每年定期對(duì)菌株進(jìn)行抗生素敏感性監(jiān)測(cè)，在選擇藥物時(shí)不能僅僅依靠經(jīng)驗(yàn)，而應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇最有效的藥物控制大腸桿菌病。在臨床上應(yīng)停用已普遍產(chǎn)生耐藥性或已明顯無(wú)效的藥物，選用目前應(yīng)用較少、經(jīng)藥敏試驗(yàn)證明對(duì)大腸桿菌敏感的藥物。

6 結(jié)論

（1）會(huì)澤縣存在仔豬黃白痢耐藥性大腸桿菌，其中少數(shù)耐藥性菌株甚至能產(chǎn)生ESBLS。

（2）產(chǎn)ESBLS菌株SHV和CTX-M基因檢測(cè)呈陽(yáng)性。

（3）產(chǎn)ESBLS菌株具有較強(qiáng)的致病性。

（4）從本實(shí)驗(yàn)可看出，目前楚雄州存在的致病性大腸桿菌除對(duì)頭孢噻肟、頭孢他啶及多粘菌素外的其他7種常抗生素即：強(qiáng)力霉素（四環(huán)素類）、慶大霉素（氨基糖苷類）、阿莫西林（青霉素類）、環(huán)丙沙星（喹諾酮類）、氧氟沙星（喹諾酮類）、氨芐西林（青霉素類）、青霉素G（青霉素類）均表現(xiàn)不同程度耐藥性。

[1]顧欣，金凌艷，蔡金華，等.國(guó)家動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)工作的探討和建議[J].中國(guó)獸藥雜志，2009，（7）：45-50.

[2]張秀英，蘆秀梅.大腸桿菌對(duì)獸醫(yī)臨床抗菌藥物耐藥性情況分析[J].中國(guó)獸藥雜志，2003，37（3）：33-50.