肝移植術后移植物抗宿主病診治進展

楊靖波（天津市第一中心醫院器官移植中心，天津市器官移植重點實驗室，天津 300192）

肝移植術后移植物抗宿主病（graft-versushost disease，GVHD）比較罕見，發生率約為0.1%～2.0%，病死率大于75%。累及肝外多個系統，可侵犯包括周身皮膚、消化道黏膜、神經系統、骨髓等，臨床表現不典型，多出現發熱、皮疹、腹瀉、癲癇、骨髓造血停滯等表現，但缺乏明確診斷的客觀依據。

早在50多年前Billingham［1］就提出GVHD是供體T細胞與受體組織間的免疫反應。其發生需要以下條件：① 移植物中含免疫活性細胞；② 受體表達與供體不同的組織抗原；③ 受體對移植物的細胞缺乏免疫反應。

1 GVHD的發生機制

GVHD的發生相當復雜，危險因素包括人類白細胞抗原（HLA）匹配度、供受者年齡、患者免疫狀態、移植前輸血、再次肝移植、多器官聯合移植等。其發生尤其與主要組織相容性抗原（majorhistocompatibilityantigen，MHA）的相合程度密切相關。可能的機制包括：① 相容性抗原的差異；② 供者免疫活性T淋巴細胞及自然殺傷細胞（NK細胞）；③ 細胞因子網絡。

1.1 相容性抗原的差異：供受體間組織相容性抗原的差異是GVHD的始發因素。供者T淋巴細胞識別宿主不同的主要組織相容性復合物（MHC）抗原而增殖分化，并對含有該MHC抗原的某些受體組織或器官進行免疫攻擊，發生GVHD。在HLA相合的移植中，次要組織相容性抗原的差異在GVHD的發生中起了重要作用［2］。

1.2 供者免疫活性T淋巴細胞及NK細胞：供者T細胞是GVHD發生的關鍵因素［3］。同種反應性細胞毒T細胞與分泌細胞因子的輔助T細胞可通過細胞毒反應和（或）釋放淋巴因子參與GVHD的發生。Th1與Th2相互制約，機體通過調節Th1/Th2比例，維持細胞免疫和體液免疫的平衡。另外，有人發現,患者在移植前如果體內NK細胞活性正常或增高時，移植后則易發生GVHD。

1.3 細胞因子網絡：GVHD被認為與Th1和Th2亞群所分泌的細胞因子失去平衡有關。目前大多數國外研究認為，腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白細胞介素-1（IL-1）、IL-2及IL-6等在GVHD發生發展中發揮重要作用，其他細胞因子如IL-12、γ-干擾素（IFN-γ）、IL-18，Th2細胞因子如IL-4、IL-10、IL-13等也與GVHD的發生密切相關［4］。

肝移植術后GVHD根據不同的發病原因可分為兩類：一類是血型ABO不相容所致的GVHD體液反應，其發生機制是供肝攜帶的淋巴細胞產生抗宿主紅細胞抗體，導致受體發生溶血性貧血。這類過程常發生在移植手術后1～2周。這類疾病大多具有自愈性，個別嚴重貧血的患者可行輸血治療。另一類即文獻中及臨床上常描述的，供體T細胞所導致的細胞免疫性GVHD，其發生機制是供肝內的T細胞識別宿主MHC或次要組織相容性抗原而激活，隨后發生克隆性分化和擴增。致敏T細胞分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子，形成細胞因子風暴（cytokinestorm），并進一步激活自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）及抗宿主細胞的毒性T 淋巴細胞（cytolytic T lymphocyte，CTL），進而導致一系列的正反饋連鎖反應，最終作用于受者皮膚、消化道及骨髓等器官，引起嚴重的臨床癥狀［5-6］。

近年來，Socié等［7］提出將GVHD發生的病理過程分為5個步驟：① 預處理導致組織損傷釋放促炎性細胞因子，激活抗原呈遞細胞及供者T細胞增殖；② 共刺激信號激活異源反應性T細胞；③異源反應性T細胞擴增與分化；④ 活化的異源反應性T細胞遷移到GVHD靶組織；⑤ 效應性T細胞破壞靶組織。

2 GVHD的診斷

Triulzi等［6-8］將肝移植術后GVHD的診斷標準歸納為以下三點：① 靶器官受累引起的特征性臨床癥狀和體征，如皮膚、消化道、骨髓等；② 受累及的器官組織學檢查；③ 受累及的器官或外周血中供體淋巴細胞存在的人類白細胞抗原（HLA）或DNA證據。到目前為止，肝移植術后GVHD的確診仍是個挑戰。受體外周血中出現供體細胞數量大于受者外周血有核細胞數量的1%時，再加上皮疹、發熱、腹瀉、全血細胞減少等臨床表現，即高度提示肝移植術后GVHD。綜合分析各種因素在疾病過程中的作用，將有助于提出新的特異性診斷指標，正確判斷病情發展，及早采取有效的預防措施，也有助于指導臨床GVHD的治療，完善治療方案。

2.1 以下是肝移植術后GVHD常見臨床表現

2.1.1 GVHD相關皮膚、黏膜損傷：GVHD和中毒性表皮壞死松解癥（TEN）均是肝移植術后少見而嚴重的并發癥。嚴重的急性GVHD和TEN因臨床表現相似，鑒別診斷比較困難，兩者病理機制仍不明確。目前認為肝移植術后GVHD患者出現腹瀉是由于細胞毒T細胞攻擊胃腸道黏膜所致，免疫組化結果發現受者循環系統中存在淋巴細胞嵌合現象對診斷有重要作用［9］。皮膚活檢可用于早期排查，如活檢發現表皮基底層呈空泡樣改變，苔蘚樣淋巴細胞浸潤、角化不良、嗜酸粒細胞壞死等組織學特征，則高度提示GVHD，但特異性較差。若胃、十二指腸或結腸黏膜活檢提示黏膜細胞凋亡并發現供者淋巴細胞浸潤高度提示為GVHD。Jeanmonod等［10］報道1例肝移植術后病情急性進展的患者，肝移植術后10日，患者無明顯誘因出現發熱、皮疹、腹瀉、骨髓造血停滯等，皮膚活檢提示TEN，內鏡見食道、胃黏膜多處糜爛，活檢示非特異性炎癥反應，免疫組化結果嵌合達40%以上，結合臨床提示GVHD。激素沖擊并廣譜抗菌藥物預防感染，皮疹消褪。患者最終因免疫功能低下合并嚴重感染，發病2周后死于感染性多器官功能衰竭。

1961年有學者發現，抗菌藥物治療異基因骨髓移植的嵌合體小鼠，可以明顯降低小鼠的死亡率。一項在allo-BMT小鼠中所進行的研究發現，飼料中給予小鼠難吸收的抗菌藥物，使小鼠成為無菌小鼠，可明顯降低移植小鼠的死亡率。在無菌受鼠中，未發現任何移植小鼠死于GVHD，而在無抗菌藥物飼養的對照組中，95%的小鼠移植后100天死于GVHD［11］。在一項以狗為對象的研究中也獲得了類似的結果。在接受allo-BMT的實驗狗中給予難吸收抗菌藥物進行選擇性腸道滅菌治療，主要排除胃腸道中的需氧菌，而保留厭氧菌。由于腸道內源性菌群（主要為厭氧菌群）的存在，有效地抑制了外源性微生物在狗腸道中的繁殖，明顯地降低了GVHD的發病率和發病程度［12］。

2.1.2 神經系統損害：越來越多的證據表明，GVHD也是移植術后發生神經系統并發癥的危險因素。有報道顯示，在GVHD模型鼠的腦組織中見到淋巴細胞浸潤現象［13-14］。Hartrampf等［15］研究發現，在異基因造血干細胞移植GVHD鼠的中樞神經系統中檢測到供者來源的活化T淋巴細胞浸潤，以及受者神經細胞及膠質細胞死亡現象，研究中同時發現GVHD受者學習、記憶能力下降，焦慮行為表現增加。

2.1.3 骨髓造血停滯：GVHD能抑制骨髓造血，造成白細胞及血小板減少，甚至發生貧血、再生障礙性貧血。免疫組化分析可發現供受體嵌合現象，然而發生機制尚不明確。在GVHD發生早期，骨髓活檢常提示一系血細胞（常首先為粒細胞系）減少，骨髓表現為輕微抑制。后期骨髓象示骨髓嚴重發育不良，各系血細胞減少，嚴重再生障礙性貧血表現。一旦出現這種情況，很難糾正，患者最終常因膿毒癥或全身多器官功能衰竭而死亡。

2.2 關于嵌合的檢測：1992年Starzl等［16］提出，肝、腎器官移植后長期生存的受者，其嵌合體不僅存在于移植器官，而且存在于全身。移植肝臟中約1×l09個細胞源于供者白細胞，包括單核細胞、T淋巴細胞、NK細胞，進入受者體內，目前已在受者多個器官，包括血液、淋巴結、皮膚、腸中發現，在長期存活的器官移植受者體內建立了穩定的嵌合狀態。微嵌合體為受者全部有核細胞含供者細胞＜1%，微嵌合體理論認為供-受者微嵌合體是耐受的前提。系統性嵌合體（即受者全部有核細胞含供者細胞＞1%）在確定GVHD的受者中較普遍［17］。關于微嵌合體能否促進異體移植耐受性還存在爭議。認為不能促進異體移植耐受的觀點主要有：① 微嵌合體在器官移植耐受者中不普遍存在；② 微嵌合體是偶發現象，不能誘導耐受性。關于嵌合體的檢測方法，目前常用的是聚合酶鏈反應（PCR），示例如下。

2.2.1 多聚合酶鏈反應-短串聯重復序列（PCRSTR）：是一類高度多態性的遺傳標志，由2～7個堿基對組成的核心序列經過幾次到十幾次重復，構成長度100～400 bp的特定DNA片段，又被稱為“微衛星DNA”，是基因嵌合檢測中非常敏感和特異的檢測方法［18-21］，被大多數醫院接受。PCR-STR可以快速檢測受體內外周血中供體DNA，且不受供受體間HLA匹配影響，檢測嵌合體時具有多態性高、結果穩定可靠等特點，其檢測靈敏度可達1%。研究發現，肝移植術后出現GVHD特異性臨床癥狀，且皮疹區組織活檢行PCR-STR檢測提示20%以上的供體CD3+T淋巴細胞，就可確診GVHD。

2.2.2 PCR-SSP ：Taylor等［22］采用 PCR-SSP HLA分型篩選33例臨床上懷疑為GVHD的患者，檢查他們是否有供體細胞嵌合體的證據；其中7例患者檢測到供體DNA，并經過流式細胞儀進行了確認。這7例患者中有5例在出現GVHD癥狀時行PCR。SSP檢測到他們體內供體CD3+細胞的水平為20%～50%；另外2例患者在行肝移植4周后進行檢測，結果分別為4%和8%。最終高嵌合表達的5例患者都死于肝移植后GVHD，另外2例也最終確診為GVHD。Uchiyama等［23］借助HLA匹配度更高的活體肝移植分析HLA匹配是否對受體預后產生影響，以及HLA匹配與GVHD的關系。結果顯示，HLA高匹配度不僅影響移植物遠期預后，同時也是致命性GVHD的危險因素。

2.2.3 細胞因子檢測：GVHD是由供者T細胞介導、通過細胞毒作用和分泌炎癥細胞因子等機制導致組織損傷，可侵犯皮膚、胃腸道、肝臟、肺部等多種器官和組織［24］。很多研究機構開始將重點放在CD4+T細胞亞群及其效應因子免疫調控方面。其中包括Th17、IL-17、Th22、IL-22、Tr1及IL-10、IL-1、IL-18、IL-17A、趨化因子等。有研究提出Toll樣受體也與GVHD有一定關系，他可能通過誘導抗原呈遞、調控炎癥細胞因子分泌或直接影響Th細胞功能等途徑，影響GVHD的發生發展。

GVHD重在預防，首先是供體的選擇，盡量避免使用HLA位點相近的供體；其次供肝處理過程中，盡量耗竭供體中的T細胞；然后對HLA配型相近或年齡較大的受者，術后應用比較溫和的免疫抑制方案，但這也可能增加受體發生排斥反應的風險。目前GVHD確診尚存在困難，治療更是爭論不斷，包括免疫抑制劑的調整、激素的應用，甚至炎性細胞因子拮抗劑的應用均存在爭議［25］。現在臨床預防及治療GVHD，主要是通過使用免疫抑制劑以及去除移植物中的T淋巴細胞，也有報道是通過利用免疫細胞的免疫調節作用，干預細胞因子達到預防與治療GVHD的目的，但因為GVHD發生機制尚不明確，且免疫系統呈網絡式表達與相互制約，GVHD免疫調節方面的預防與治療仍處在初期階段。曾有研究報道使用CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞預防GVHD，提高臨床HIA半相合造血干細胞移植（HSCT）的成功率［26-28］，Bacchetta等［29］將體外誘導得到的同種異體抗原特異性Trl細胞作為HSCT的輔助治療手段。該方法是在體外將供者T淋巴細胞與受者外周血單個核細胞（PBMC）與IL-10共培養，然后將誘導分化得到的T淋巴細胞輸注到接受HLA半相合的HSCT患者體內。應用該方法誘導分化得到的T細胞中除了有大量同種異體抗原特異性Trl細胞，還包含了初始以及記憶性T細胞，所以與單純接受移植治療的患者比較，急性GVHD的程度較輕，而且未發生慢性GVHD。有研究發現，人的間充質干細胞（BMMSC）在體外具有免疫負調節作用［30］。Le Blanc等［31］的實驗結果表明，BMMSC對混合淋巴細胞反應有顯著的免疫調節作用。胡文兵等［32］實驗發現，BMMSC在體內對不同的T細胞亞群表現出不同的調節作用。BMMSC聯合移植組與單純異基因骨髓移植組比較，CD4+細胞數量明顯減少，CD8+細胞數量明顯增多，說明BMMSC在體內能夠減少CD4+細胞數量，同時增加CD8+細胞數量。

GVHD發生機制尚不明確，診斷困難，治療往往延誤，GVHD患者最終常因膿毒癥等死亡，故應常規監測，盡早給予敏感抗菌藥物及有針對性的支持治療是有必要的。關于細胞因子在GVHD中的作用，目前的研究尚缺乏系統性，其潛在有效性尚需大量實驗予以進一步證實與探索。