MicroRNA與非小細胞肺癌

【摘要】肺癌已經成為全球范圍內因癌癥導致死亡的首要原因，當今由于缺乏有效的指導臨床診斷和治療的腫瘤分子標志物，所以非小細胞肺癌患者的療效不佳。Micro RNA(以下簡稱miRNA)是真核生物中一類長度約為22個核苷酸的參與基因轉錄后水平調控的小分子非編碼RNA。miRNA在肺癌中發揮原癌基因及抑癌基因的作用，在肺癌的發生、發展過程中均發揮著重要作用。miRNA不僅可以在石蠟包埋組織和體液中保持穩定，而且在血清和血漿中也可以穩定存在，這個特性使循環miRNA有望成為一種新型分子標志物，為肺癌的早期分子診斷、預測預后及治療效果開辟了一個新的研究領域。

基金項目:國家自然科學基金(81101773)，北京市科委重大項目(D14110700020000)，首都醫科大學基礎-臨床科研合作基金(14JL25)資助。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81101773); Major Project of Beijing Municipal Science and Technology Commission(D14110700020000); Capital Medical University Foundation-clinical Research Cooperation Fund(14JL25)．* Corresponding author，E-mail: xiuyizhi@ aliyun．com

網絡出版時間: 2015－07－16 22∶20網絡出版地址: http:∥www．cnki．net/kcms/detail/11．3662．r．20150716．2220．001．html

MicroRNA and non-small cell lung cancer

Tan Xiaogang，Zhi Xiuyi *

(Department of Thoracic Surgery，Xuanwu Hospital，Diagnostic and Treatment Centers of Lung Cancer，Capital Medical University，Beijing 100053，China)

【Abstract】Lung cancer has the highest world-wide cancer mortality．Current therapies for non-small cell lung cancer(NSCLC)patients are inefficient due to the lack of diagnostic and therapeutic markers．MicroRNAs(miRNAs)are a species of small non-coding singlestranded RNA of about 21 nucleotides that through partial sequence homology may interact with the 3’-untranslated region of target mRNA molecules．Recent evidence has shown that miRNA may function as tumor supressors or oncogenes，and alterations in miRNA expression may play a critical role in the initiation and progression of lung cancer．miRNAs are not only stable in paraffin embedded tissues and body fluids，but also in plasma and serum，which makes circulating miRNA a new kind of ideal biomarker that opens a new field for early molecular diagnosis of lung cancer，as well as for prediction of lung cancer survival and therapy．

【Key words】microRNA; circulating miRNA; lung cancer; diagnosis; prognosis; therapy

在世界范圍內，肺癌是惡性腫瘤的首位死因，約占惡性腫瘤死因的30% ［1］。根據國家癌癥中心全國腫瘤防治研究辦公室 ［2］統計，我國年齡標準化后肺癌5年生存率僅為16．1%，由于缺乏有效的指導臨床早期診斷和治療的腫瘤分子標志物，所以肺癌患者的療效不佳。Micro RNA(以下簡稱miRNA)是一類廣泛存在于動物、植物和病毒中的小相對分子質量的非編碼蛋白的RNA分子。成熟的miRNA分子大小為20～25 nt ［3］。目前在人類細胞中約存在1 000多種miRNA(其中經過證實的約400多種)，其數量只占蛋白編碼基因的約1%，卻調節約30%的基因的表達 ［4-5］。約50%的miRNA定位于在腫瘤中擴增或缺失的染色體脆性位點或區域 ［6］。研究 ［6］證實miRNA表達譜與肺癌的類型、進展、患者生存率及預后等均有密切聯系。miRNA可以作為腫瘤抑制因子和癌變的促進因子調控細胞增生、凋亡、侵襲、轉移和血管生成等。同一miRNA可影響多種蛋白編碼基因，而同一基因又可受多個miRNA影響。miRNA在腫瘤發生發展中的作用及其作為腫瘤診斷、預后標志物及治療靶點的研究方興未艾。

1　miRNA的生成及作用機制

miRNA起源于細胞核內，大部分miRNA的編碼基因定位于mRNA編碼基因的內含子區，還有少數miR-NA的編碼區定位于遠離mRNA編碼基因的DNA區域或mRNA編碼基因的3’UTR。miRNA的加工成熟分兩步，RNA聚合酶Ⅱ作用下轉錄出的pri-miRNA(primary-miRNA)長約1 000 bp，具有5’帽結構和3’polyA尾結構以及中間的頸環結構 ［7］; Drosha酶(RNAseIII類的核酸內切酶)酶切作用后成為只有頸環結構的premiRNA(長約60 bp); exportin5/RanGTP將其運輸出核后，細胞質中的Dicer(RNAseⅢ類的核酸內切酶)將其酶切成miRNA: miRNA雙鏈結構，經進一步的選擇機制解鏈釋放成熟miRNA，成熟miRNA進入核蛋白體復合物miRNP發揮其調節靶基因活性 ［8-10］。在動物細胞中成熟miRNA主要通過與下游靶基因的mRNA的3’UTR以非完全匹配方式結合，干擾和抑制mRNA的翻譯;另一種作用機制是將結合的mRNA運輸至P-body，在其中脫腺苷酸化作用后，核酸酶對靶mRNA進行酶切降解。

2　miRNA的鑒定

目前檢測miRNA的方法主要有RNA印跡(Northern blotting)，實時定量PCR(RT-PCR)，基因芯片技術和二代測序等。

2．1 Northern blotting分析方法

Northern印跡是研究miRNA表達水平最可靠的技術，它常用于在腫瘤細胞中檢測miRNA表達水平。從1993年開始，Northern blotting就被用于miRNA基因的研究中，但Northern blotting操作繁瑣、樣本量需求大、靈敏度較低，不適用于大量臨床樣本的檢測 ［11］。

2．2實時定量PCR

實時定量PCR(RT-PCR)可快速檢測出miRNA尤其是Pri-miRNA的表達。2005年RT-PCR被用于222種miRNAs在人類腫瘤細胞系中的表達研究 ［12］。該方法可以定量分析前體miRNAs和非活化的、成熟的miRNAs，但是對于前體miRNAs和成熟miRNAs之間的表達關系，并不是很清楚。由于其具有較高的靈敏度、重復性和特異性，已成為現階段核酸分子定量檢測的金標準，根據引物的不同，RT-PCR可以分為莖環法和加尾法，莖環法特異性較高 ［13］。

2．3 miRNA基因芯片

miRNA基因芯片技術是一種快速有效的檢測miRNA表達圖譜的方法，它能同時檢測多個miRNA。芯片技術的應用實現了在全基因組水平鑒定成熟miRNA的表達?？捎诙虝r間內同時鑒定所有已知miRNA的表達譜，成為高通量檢測的最佳選擇。芯片方法的前提是分離到高質量的miRNA組分，由于存在背景及混雜信號干擾，重復性較差，主要用于miRNA的初篩，其結果還需采用RT-PCR等方法加以驗證。

2．4二代測序

新一代大規模測序技術主要用于未知序列miRNA的定量檢測，有高通量、準確度高的特性。目前市場上主流的測序技術有454焦磷酸測序技術 ［14］、Solexa合成測序技術 ［15］和SOLID連接測序技術 ［16］，但深度測序價格昂貴，且數據量大，不適用于臨床檢測，一般用于探尋新的miRNA并對新發現的miRNA進

行功能預測 ［17］。

3　組織miRNA在肺癌診斷中的應用

miRNA在不同組織中有不同的表達。在肺癌組織與正常組織之間以及不同的肺癌組織之間，miRNA表達譜也各不相同，這也為運用miRNA檢測以便早期診斷肺癌提供可能。早期研究中，大多數miRNA表達譜的數據從組織樣本中獲取，尤其是癌組織樣本。因為miRNA非常穩定，不易降解，因此，甲醛固定的石蠟包埋組織塊可用于miRNA分離 ［14］;從組織樣本中得到數據，可以很好的詮釋miRNA的疾病參與情況。Yanaihara等 ［18］利用miRNA基因芯片分析法，對104例非小細胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)組織與正常肺組織進行miRNA表達譜的對比分析發現，有43種miRNA有明顯的表達差異，15種miRNA發生上調及28種miRNA發生下調。這些發現均為miRNA在肺癌中的研究奠定了基礎。研究 ［19］表明，5種miRNA組合(miR-34c-5p、miR-34a、miR-25、miR-191和let-7a)能夠準確地區分肺腺癌和肺鱗癌。Lebanony等 ［20］通過比較122例NSCLC患者標本(62例鱗癌，60例腺癌)表達譜，發現miR-205在區分肺鱗癌和肺腺癌時，對鱗癌的敏感度達96%，特異度達90%，是肺鱗癌高度特異的生物標志。

4　組織miRNA與肺癌的預后

肺癌的預后由多種因素決定，準確的判斷預后對于臨床治療具有重要的指導價值。以往的研究 ［21］認為與肺癌預后有關的因素有:年齡、吸煙史、TNM分期、腫瘤的病理類型、腫瘤的分化程度、治療方式的選擇、淋巴結轉移等。目前的研究 ［18，22-23］發現，miRNA也能作為肺癌預后判斷指標，而且是獨立的預后因素。Takalmzawa等 ［22］應用分層聚類法，將143例非小細胞肺癌術后病例分為let-7低表達組(l組)和let-7高表達組(2組)，兩組間在年齡、性別、組織學類型、T狀態、分化程度上差異無統計學意義。Kaplan-Meier生存曲線顯示，1組生存時間明顯短于2組，單因素Cox回歸分析顯示let-7低表達預示著更差的預后。多因素Cox比例風險模型分析顯示，let-7的表達水平是非小細胞肺癌術后的獨立預后因素，其中1組患者術后死亡的危險比(hazard ratio)是2組的2．71倍。Yanaihara等 ［18］應用單因素Cox模型發現，5種miRNA與肺腺癌預后有關，Kaplan-Meier生存曲線顯示，has-miR-155高表達與has-let-7a-2低表達預示著更短的生存期，多因素Cox比例風險模型分析顯示，has-miR-155是肺腺癌獨立的預后因素。在不同的臨床分期，miRNA也能作為判斷預后的指標。41例1期肺腺癌患者中，有3種miRNA(hsa-miR-155、hsa-miR-17-3P和hsa-miR-20)表達變化與預后有關，這說明即使是肺腺癌的早期，miRNA檢測也能對疾病的預后進行判斷。Tan等 ［23］利用miRNA芯片對60例冰凍肺鱗癌與癌旁組織進行了雜交，建立了肺鱗癌特異的miRNA表達譜。發現miRNA-31在肺鱗癌中的表達發生了明顯上調，其表達越高，預后越差。Cox回歸分析，miRNA-31是其獨立預后因素，并用real time-PCR證實。

5　組織miRNA與肺癌的治療

針對肺癌的治療，臨床應用上主要還是以鉑類為基礎的雙藥聯合化學藥物治療(以下簡稱化療)。提高療效一方面可通過新藥研發，另一方面也可通過提高腫瘤細胞對藥物治療的敏感性實現。已有研究 ［24-26］發現，部分miRNA可提高肺腺癌細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，如Bian等 ［24］發現，上調miR-451能提高NSCLC(A549)對順鉑的敏感性。Ceppi等 ［25］報道稱，下調miR-200表達能夠增加NCI-H1299細胞對順鉑和西妥昔單抗的抵抗性。Weiss等 ［26］發現miR-128b雜合性丟失的肺癌細胞對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)吉非替尼十分敏感，而miR-128b未丟失的肺癌細胞H520對吉非替尼敏感性不強。而且臨床試驗證實，miR-128b雜合性丟失的肺癌患者經吉非替尼治療后，中位生存期為23．4個月，明顯高于miR-128b未丟失患者的10．5個月。因此聯合基因剔除和吉非替尼治療肺癌可使肺癌患者獲得更好的療效。另一項研究 ［27］發現，無論是否吸煙、EGFR是否突變(突變型對EGFR-TKI敏感)，低表達miR-21聯合EGFR-TKI均可誘導肺癌細胞的凋亡，提示miR-21可能成為肺癌靶向治療的有效靶點。此外，Cui等 ［28］觀察到，在對多西他賽耐藥的肺腺癌細胞中，miR-let-7c的表達明顯下調，而額外增加其表達可增加細胞的放化療敏感性;相反地，應用針對let-7c的抑制劑可降低腫瘤細胞的放化療敏感性。在肺腺癌的化療耐藥分子機制研究中，let-7c起著重要的作用。針對EGFR基因突變型的肺腺癌患者，酪氨酸激酶抑制劑如吉非替尼有效率高，不良反應小，已經可替代化療作為二線或三線治療的選擇。

6　循環miRNA與肺癌

目前，腫瘤的早期診斷，特別是非侵襲性的早期診斷方法逐漸受到重視。通過檢測血液中的核酸或蛋白，對易感人群進行早期篩查成為目前腫瘤診斷研究的熱點。研究 ［29］發現，miRNA表達譜在血清和血漿中差異無統計學意義。miRNA在血清中穩定，能抗RNA酶降解，腫瘤的miRNA能夠進入血液循環，血液中的miRNA量可以在一定程度上反映腫瘤的大小，因此有望通過測量血液中的miRNAs來診斷、監測腫瘤。循環miRNA可穩定存在于血液中的原因可能包括:(1)血漿中的絕大多數miRNA與脂類或脂蛋白復合物結合，從而免受核糖核酸酶的降解 ［30］;(2)循環miRNA由相應組織分泌后被微囊泡等載體捕獲，進而運載至受體細胞發揮作用 ［31］;(3)循環miRNA主要與Ago2蛋白等RNA相關蛋白結合形成復合物而穩定存在于血液中 ［32］。雖然循環miRNA在血液中的存在形式尚有爭議，但其具有的良好穩定性已被大家認可。自1999年與腫瘤相關的miRNA從乳腺癌、結腸癌患者血清或血漿中檢測出來至今 ［30］，檢測血液中cirDNA用于診斷惡性腫瘤已成為近年的研究熱點課題之一。循環miRNA良好的穩定特性使其作為一種新興的非侵入性生物標志物為肺癌的早期診斷、治療及預后判斷提供了新的思路。6．1循環miRNA與肺癌診斷

近幾年，進行低劑量胸部CT對有吸煙史的肺癌高危人群早期篩查是減少高危人群癌癥病死率的有效措施。然而由于低劑量胸部CT高假陽性率，目前還無法運用低劑量胸部CT對高危人群中無癥狀的肺癌患者進行明確診斷。利用miRNA在肺癌組織中的高特異性，意大利的研究者進行了一項大規模研究 ［33］發現，僅選取血中24個miRNAs對肺癌的早期診斷率其靈敏度87%，特異度81%，陰性預測值高達99%，而低劑量胸部CT對于肺癌早期診斷率分別為靈敏度79%，特異度81%，陰性預測值為19．4%。將兩者結合來對肺癌進行早期診斷，其假陽性率大大下降至3．7%。Chen等 ［34］在肺癌患者血清中發現了63種在健康人血清中不存在的miRNA，其中10種為肺癌所特異的，并在后續對400例NSCLC患者及220例健康對照者的回顧性研究發現在臨床診斷NSCLC之前的33個月，使用上述10 種miRNA就可鑒定出相應的血清樣本。Gilad等 ［35］對451例不同類型的肺癌患者的研究顯示，miRNA可作為一種非侵襲性的診斷方法來區分肺癌的病理類型，與病理學結果比較，其鑒別鱗狀細胞癌、非鱗癌的NSCLC、類癌、SCLC的精確度高達94%。6．2循環miRNA與肺癌預后

Van der Drift等 ［36］進行了一項長達6．5年的隨訪研究，結果顯示首次診斷NSCLC時，血漿循環DNA水平高往往提示患者預后差。Sirera等 ［37］對446例Ⅲ和Ⅳ期的NSCLC患者進行平均為期9．7(15～45)個月的隨訪研究顯示，循環DNA是患者進展中位時間和總生存率的獨立預測標志物，它是一種非侵襲性的預測進展期NSCLC患者預后的標志物。Hu等 ［38］研究了肺癌患者血清miRNA表達譜與生存期之間的關系。按生存時間將303例Ⅰ～Ⅲa期NSCLC患者分為長存活組(30例，平均生存期49．5個月)和短存活組(30例，平均生存期9．54個月)，比較兩組血清miRNA水平，根據其中差異有統計學意義的4種microRNA(miRNA-486、miRNA-30d，miRNA-l，miRNA-499)組成的表達譜，將患者分為高危組和低危組，低危組中位生存期明顯高于高危組(18．43個月vs尚未達到，P＜0．0001)，提示這4種血清microRNA組成的表達譜可用于生存預測，是影響NSCLC患者總生存的獨立預后因素。Silva等 ［39］采用芯片技術檢測發現，血清miR-30-3P和let-7f的濃度與肺癌患者的無病生存率和總生存率顯著相關;血清miR-30-3P和let-7f的高水平表達與肺癌患者預后不良相關。Kaduthanam等 ［40］通過檢測早期可切除肺腺癌患者血清中的miRNA水平，證實miR-142-3p與腫瘤的復發高風險相關，在術后24個月內復發的患者，其水平往往升高，提示miR-142-3p可能作為一個評價復發風險的血清指標。

6．3循環miRNA與肺癌治療

Wei等 ［41］對35例晚期NSCLC行2～3周期的含鉑方案化療后評估療效，其中11例部分緩解(partial response，PR)，13例疾病進展(progressive disease，PD)，11例病情穩定(stable disease，SD)，化療無效的PD和SD患者的血清miR-21明顯高于化療有效的PR患者(P=0．049)，血清miR-21在化療有效的PR患者與對照組間差異無統計學意義(P=0．130)，提示血清miR-21表達可能與NSCLC患者的化療敏感性有關。Cui等 ［42］采用RT-PCR技術對260例以鉑類治療為主的晚期NSCLC患者和260例健康成年人血漿中的miRNA(miR-125b，miR-10b，miR-34a及miR-155b)進行檢測，發現與健康成年人相比，4種循環miRNA在NSCLC患者血漿中的表達明顯增高，而且miR-125b在低分化肺癌中的表達明顯高于高、中分化者，但miR-10b、miR-34a及miR-155b在不同分期的肺癌患者血漿中的表達水平差異無統計學意義。研究人員還發現在檢測的4種循環miRNA中，只有miR-125b在無治療反應的患者血漿中高表達，這表明miR-125b與治療反應有顯著關系。這一研究結果對于NSCLC靶向治療的開展具有非常重要的臨床意義。

7　痰液及胸腔積液中miRNA的研究

研究 ［43］報道在人血清、血漿、尿液、唾液及其他體液中均有miRNA表達。肺癌患者痰液也是值得留取和檢測的有價值的標本。Xing等 ［44］對6個miRNA進行RT-PCR檢測，結果表明聯合3個miRNA : miR-205、miR-210、miR-708用以診斷肺鱗癌的敏感度和特異度分別為76%和96%。聯合4個miRNA: miR-21、miR-486、miR-375、miR-200b，在診斷肺腺癌時的敏感度和特異度分別是80．6%和91．7% ［45］。

Han等 ［46］比較了107例包括良性胸腔積液及肺腺癌導致的惡性胸腔積液病患中胸腔積液的miRNA水平，發現相對于良性胸腔積液患者，miR-198在惡性胸腔積液中被下調，而在與肺腺癌的傳統腫瘤標志物例如CEA、CYFRA21-1的比較中，其診斷價值與CEA相當，但略優于CYFRA21-1，miR-198診斷惡性胸腔積液的敏感度為89．2%，特異度為85．0%。

8　小結

綜上所述，miRNA幾乎參與肺癌發生、發展的全過程，在肺癌的診斷、預后及治療中都具有重要的作用。循環miRNA分子作為一種新的生物學標志物具有創傷小、可重復、易獲取的優點，可用于預測肺癌患者化療療效及動態監測治療效果，并可作為治療靶標 ［47］。但肺癌相關特異性miRNA表達譜的篩選、檢測方法及檢測程序的標準化、適合的內參基因的選擇等仍是今后血清miRNA研究中需要解決的問題。雖然相關研究尚處于起步階段，相信隨著檢測方法的成熟和研究的深入，血清microRNA未來會在肺癌的預測、診斷、預后評估、個體化治療等方面擁有美好的應用前景。