塞來昔布衍生物抑制劑CIH01對A549肺癌增殖及血管生成影響的實驗研究

李宏軼喻斌

（1江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司 南京210046；2南京中醫(yī)藥大學藥學院 江蘇南京210046）

塞來昔布衍生物抑制劑CIH01對A549肺癌增殖及血管生成影響的實驗研究

李宏軼1喻斌2

（1江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司 南京210046；2南京中醫(yī)藥大學藥學院 江蘇南京210046）

目的：探討選擇性環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑塞來昔布衍生物CIH01對A549肺癌移植瘤的抑制作用及其對肺瘤組織血管生成的影響。方法：建立裸鼠肺癌細胞株A549移植瘤模型，連續(xù)治療20 d，于末次給藥24 h后處死動物。每周測量2次腫瘤體積及動物體重，以末次各組瘤體積計算抑瘤率。采用Mtrigel Plug實驗方法，連續(xù)治療7 d后取出皮下膠塊，進行HE染色，計算各組血管數(shù)平均值。結果：完成全部治療后，CIH01組的平均腫瘤體積為（216±25）mm3，塞來昔布組的平均腫瘤體積（391±40）mm3，對照組的平均腫瘤體積為（633±92）mm3。CIH01的抑瘤率為64%，明顯優(yōu)于塞來昔布組，P＜0.05。各組Matrigel內(nèi)的平均血管數(shù)分別為（2.82±0.71）、（7.90±2.83）、（10.75±3.11），與塞來昔布組及對照組比較，CIH01組的平均血管數(shù)均顯著減少，P＜0.01。結論：CIH01對A549移植瘤模型有明顯抑制作用，其作用機制之一與抑制腫瘤血管生成有關。

CIH01；A549模型；環(huán)氧合酶-2；基質(zhì)膠栓實驗；血管生成

環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX），又稱前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶（PGHS），是前列腺素（PGs）合成過程中一個主要的限速酶，可將花生四烯酸（AA）代謝成各種前列腺素產(chǎn)物，從而參與機體的多種病理生理過程，如炎癥、發(fā)熱、出凝血機制等。近年來研究顯示，環(huán)氧化酶-2（COX-2）與肺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，COX-2抑制劑對肺癌可能具有防治作用[1]。選擇性環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑塞來昔布是近年來開發(fā)的新型非甾體類抗炎藥（NSAID），其藥理特點是選擇性作用于COX-2，對COX-1的活性幾乎無抑制作用，表現(xiàn)出良好的腸道安全性。本實驗室合成的COX-2選擇性抑制劑CIH01，為塞來昔布的衍生物。本實驗通過觀察其在裸鼠體內(nèi)對A549肺癌移植瘤的抑制作用，探討其

可能的作用機制。

1 試驗材料

1.1 細胞株 人肺癌細胞株A549（購自美國ATCC細胞庫）。

1.2 實驗動物 SPF級Balb/c裸鼠45只，雌性，6周齡，體重18～22 g，購自南京中醫(yī)藥大學動物中心。1.3 主要試劑 RPMI-1640完全培養(yǎng)基（購自Gibco公司），含10%滅活血清，塞來昔布（國藥準字J20080058）。BD Matrigel（CatNo：356237，購自上海偉進生物科技有限公司），Invitrogen bFGF（貨號：13256029，購自上海浩然生物技術有限公司）。

2 試驗方法

2.1 裸鼠移植瘤實驗[2]將A549細胞體外單層培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、含5%

CO2空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1周2次用胰酶-EDTA進行消化處理傳代。當細胞呈指數(shù)生長期時，收取細胞，計數(shù)。將5×106A549腫瘤細胞懸浮于0.15 ml PBS，接種于每只裸鼠的右上側(cè)軀干。當觀察到有明顯瘤塊形成后，開始用游標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V=0.5 a×b2，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。腫瘤平均體積達到120 mm3時，挑選24只腫瘤生長狀態(tài)較好的荷瘤鼠分為三組。治療組給予60 mg/kg CIH01口服，陽性對照組給予相同劑量塞來昔布，空白對照組給予等體積溶媒。連續(xù)口服給藥20 d后，于24 h后CO2麻醉處死動物。根據(jù)末次腫瘤體積計算抑瘤率，抑瘤率（%）= [1-（實驗組平均瘤體積/對照組平均瘤體積）]× 100%。

2.2 基質(zhì)膠栓（Matrigel Plug）實驗[3]12只裸鼠腹股溝皮下分別接種0.5 ml BD Matrilgel（無酚紅）與400 ng bFGF混合物后，口服給藥，連續(xù)7 d，于第8天處死動物，取出皮下膠塊，4%多聚甲醛固定，HE染色后（紅色為新生血管，藍色為基質(zhì)膠），鏡下數(shù)4個視野內(nèi)的血管數(shù)量，計算平均值。

2.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0進行所有數(shù)據(jù)分析。本實驗數(shù)據(jù)全部以（Mean±SEM）表示，用One-way ANOVA進行組間比較。如果F值有顯著性差異，在ANOVA分析之后用LSD法再進行多重比較。P＜0.05為有顯著性差異。

3 結果

3.1 CIH01對腫瘤體積的影響 裸鼠接種A549細胞1周后可見有皮下移植瘤出現(xiàn)，實驗過程中動物未出現(xiàn)明顯的精神、飲食及排便異常。完成全部治療后，CIH01組的平均腫瘤體積為（216±25）mm3，塞來昔布組的平均腫瘤體積（391±40）mm3，對照組的平均腫瘤體積為（633±92）mm3。見圖1。

3.2 各治療組膠栓內(nèi)平均血管數(shù)的變化 HE染色結果顯示，塞來昔布和CIH01兩者給藥7 d后，都可不同程度降低皮下接種膠栓內(nèi)的平均血管數(shù)。塞來昔布組的平均血管數(shù)為（7.90±2.83），較對照組（10.75±3.11）明顯更低，P＜0.05。CIH01拮抗腫瘤新生血管的作用較塞來昔布更為顯著，平均血管數(shù)僅為（2.82±0.71），與對照組相比有極顯著差異，P＜0.01。見圖2。

4 討論

環(huán)氧化酶參與機體的多種病理生理過程，如炎癥、發(fā)熱、出凝血機制等是已經(jīng)公認的事實。近幾年來，國外諸多研究表明，COX-2除了在上述炎癥等過程中發(fā)揮重要作用外，還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關，已經(jīng)成為腫瘤防治的一個新靶點。COX-2促進腫瘤發(fā)生的分子機制主要涉及促進腫瘤新生血管的生成[4]、刺激腫瘤細胞的增殖[5]、抑制腫瘤細胞的凋亡[6]及促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[7]等多種機制。很多證據(jù)表明，COX-2的高表達與胃腸癌、肝癌、乳癌、胰腺癌等多種腫瘤關系密切[8～9]，并且在非小細胞肺癌尤其腺癌中亦呈現(xiàn)陽性表達[10]，且COX-2高表達者的肺癌細胞具有更高的侵襲性和淋巴結轉(zhuǎn)移傾向，且預后不良[11]。本實驗選擇已知COX-2高表達的肺腺癌細胞系A549作為研究對象，對新一代非甾體類抗炎藥選擇性COX-2抑制劑塞來昔布的新型衍生物CIH01的體內(nèi)抗腫瘤活性進行評價，并同時用塞來昔布進行比較。實驗結果表明，溶媒對照組的腫瘤體積在實驗結束時達到了633 mm3，CIH01在60 mg/kg劑量下，連續(xù)給藥20 d，表現(xiàn)出顯著的抑瘤作用，平均瘤體積為216 mm3（P＜0.01），TGI值為64%。其作用明顯好于相同劑量的塞來昔布（腫瘤體積為391 mm3，TGI=38%），兩組間比較有顯著性差異（P＜0.05）。

腫瘤組織新生血管形成在腫瘤的生長、浸注和轉(zhuǎn)移過程中起著極其重要的作用，腫瘤血管的生成與許多促血管生成因子的調(diào)節(jié)密切相關，bFGF是其中一種重要的血管生成促進因子。本實驗結果顯示，COX-2抑制劑塞來昔布及其衍生物CIH01都具有明顯的抗腫瘤新生血管生成的作用。與塞來昔布比較，其衍生物具有更為明顯的抗血管生成活性（P＜0.05），兩者的平均血管數(shù)分別為（7.90±2.83）和（2.82±0.71）。該結果與A549腫瘤模型的實驗結果基本一致。由此我們也認為，抗腫瘤血管生成作用是塞來昔布及CIH01等COX-2抑制劑抗腫瘤的一個重要機制。 盡管COX-2抑制劑塞來昔布的抗腫瘤機制尚未完全闡明，但我們的研究從體內(nèi)試驗揭示了塞來昔布及其衍生物CIH01對肺癌有抗腫瘤效應。鑒于塞來昔布用于治療肺癌已經(jīng)有多個臨床實驗在進行，因此，我們相信抗腫瘤活性更強且毒性較低的衍生物CIH01在抗腫瘤方面，將具有更加廣闊的應用前景。

[1]Mao JT,Roth MD,Fishbein MC,et al.Lung cancer chemoprevention with celecoxib in former smokers[J].Cancer Prev Res(Phila),2011,4 (7):984-993

[2]Shao C,Zhao L,Wang K,et al.The tumor suppressor gene RBM5 inhibits lung adenocarcinoma cell growth and induces apoptosis[J]. World J Surg Oncol,2012,10:160

[3]Angiolillo AL,Sgadari C,Taub DD,et al.Human interferon-inducible

參考文獻

protein 10 is a potent inhibitor of angiogenesis in vivo[J].J Exp Med, 1995,182(1):155-162

[4]Ruegg C,Dormond O,Mariotti A.Endothelial cell integrins and COX-2:mediators and therapeutic targets of tumor angiogenesis[J]. Biochim Biophys Acta,2004,1654(1):51-67

[5]Murakami M,Naraba H,Tanioka T,et al.Regulation of prostaglandin E2 biosynthesis by inducible membrane-associated prostaglandin E2 synthase that acts in concert with cyclooxygenase-2[J].J Biol Chem, 2000,275(42):32783-32792

[6]Tsujii M,DuBOis RN.Alterations in cellular adhesion and apoptosis in epithelial cells overexpressing prostaglandin endoperoxide synthase 2 [J].Cell,1995,83(3):493-501

[7]Bailey T,Biddlestone N,Shepherd N,et al.Altered cadherin and catenin complexes in the Barrett’s esophagus-dysplasia-adenocarcinoma sequence:correlationwithdiseaseprogressionanddedifferentiation[J]. AmJPathol,1998,152(1):135-144

[8]韓少良,花亞偉,劉永剛,等.胃癌組織中環(huán)氧合酶2的表達與胃癌惡性行為關系的觀察[J].中華普通外科雜志,2002,17(10):628

[9]王興鵬,徐遠福,王冰嫻,等.環(huán)氧合酶2對胰腺癌細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及其機制[J].中華消化雜志,2002,22(8):459-462

[10]Wolff H,Saukkonen K,Anttila S,et al.Expression of cyclooxygenase-2 inhumanlungcarcinoma[J].CancerResearch,1998;58(22):4997-5001 [11]Khuri FR,Wu H,Lee JJ,et al.Cylooxygenase-2 overexpression is a maker of poor prognosis in stageⅠnon-small cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res,2001,7(4):861-867（收稿日期：2015-01-08）

Experimental Study on the Effect of Celecoxib Derivatives Inhibitor CIH01 on the Proliferation of A549 Lung Cancer and the Angiogenesis

LI Hong-yi1,YU Bin2
(1Jiangsu Kangyuan Yangguang Pharmaceutical co,LTD.Nanjing210046;
2College of pharmacy,Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Jiangsu210046)

Objective:To evaluate the effects of celecoxib derivatives CIH01,the cyclooxygenase-2(COX-2)selective inhibitor,on inhibiting A549 lung cancer xenograft and tumor angiogenesis.Methods:Established the tumor homograft model of lung cancer cell line A549 in nude mice,after 20 days treatment,the mice were sacrificed 24 hours after the last administration.Tumor volume and body weight were measured twice weekly and calculated tumor growth inhibition (TGI)using the last measurement.Then used Mtrigel plug assay,subcutaneous rubber blocks of all mice were removed and dyed by HE after 7 days treatment,calculated the number of vessels. Results:After the treatment,the average tumor volume of CIH01 group was(216±25)mm3,the mean tumor volume of celecoxib group was(391±40)mm3,and the mean tumor volume of control group was(633±92)mm3.The inhibition rate of CIH01 group(64%)was significantly higher than that of celecoxib group,P＜0.05.And the average number of vessels of each group was(2.82±0.71),(7.90± 2.83),and(10.75±3.11),the average number of vessels of celecoxib group reduced significantly than the celecoxib group and the control group,P＜0.01.Conclusion:CIH01 has significant inhibitory effect on A549 tumor model,the mechanism of action is related to the inhibition of tumor angiogenesis.

Celecoxib;A549 xenograft model;COX-2;Matrigel plug assay;Angiogenesis

R734.42

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2015.06.001