辛伐他汀通過抑制RhoA/Rho激酶活性預防冠狀動脈痙攣機制研究

劉驊增 謝蓮娜

冠脈痙攣可引起變異型心絞痛、不穩定型心絞痛、急性心肌梗死等缺血性心臟病，其中，血管內皮細胞功能障礙及血管平滑肌細胞收縮反應增強被認為是冠脈痙攣的主要機制。RhoA/Rho激酶信號轉導通路是血管平滑肌細胞鈣離子敏感性的主要調節機制，其參與血管痙攣、動脈硬化及缺血再灌注損傷的病理生理過程，具有緩解血管平滑肌痙攣及改善內皮功能的作用，已經成為心血管病治療的新靶點。他汀類藥物是一種Rho激酶抑制劑，除降膽固醇作用外，還具有抑制炎性反應、改善內皮功能、抗氧化等作用［1，2］。本研究探討辛伐他汀改善大鼠冠脈痙攣的作用機制，為拓展冠脈痙攣治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 40只12周齡Wistar大鼠(體重250～300 g)隨機分為4組(n=10):對照組、辛伐他汀組、Rho激酶抑制劑(法舒地爾)組和聯合用藥組(辛伐他汀+法舒地爾組)。所有大鼠實驗前置于室溫18～22℃、濕度60% ～70%、通風良好的清潔飼養室內飼養1周。

1.2 動物給藥及冠脈痙攣模型構建 所有動物在冠脈痙攣模型構建前分為以下4組進行給藥處理:空白對照組:不用藥;他汀組:5 mg·kg－1·d－1辛伐他汀灌胃;Rho激酶抑制劑組:15 mg·kg－1·d－1法舒地爾腹腔注射;聯合用藥組:5 mg·kg－1·d－1辛伐他汀灌胃+15 mg·kg－1·d－1法舒地爾腹腔注射，所有用藥連續7 d。第8天，將大鼠仰臥固定在鼠板上，麻醉采用腹腔注射麻醉，按照40 mg/kg給予1%戊巴比妥鈉進行腹腔注射。動物麻醉后，連接體表心電圖，然后分別從大鼠尾動脈注射0.1 U/kg精氨酸加壓素(AVP)，用以制備冠脈痙攣模型。之后持續監測心電圖變化，觀察心電圖S-T段變化;如果空白對照組S-T段持續偏移，則提示冠脈痙攣模型制作成功，如果藥物處理組S-T段不出現明顯偏移，則提示藥物發揮預防作用。

1.3 RhoA/Rho激酶活性的測定 所有大鼠采用大劑量苯巴比妥鈉處死，放血開胸暴露心包，迅速取出心臟，將標本制成勻漿，冰浴、離心，取上清液在液氮中速凍后置于－80℃冰箱中保存備用。然后采用實時熒光定量PCR分析Rho激酶基因在冠脈痙攣大鼠用辛伐他汀和法舒地爾處理后的相對表達量。采用Western blot檢測 RhoA、GTP-RhoA、肌球蛋白磷酸酶靶亞基(MYPT1)和磷酸化MYPT1(p-MYPT1)蛋白的表達，并計算RhoA蛋白的相對活性和Rho激酶的相對活性。計算公式:RhoA蛋白的相對活性=GTP－RhoA蛋白表達量/總RhoA蛋白表達量;Rho激酶的相對活性=p－MYPT1蛋白表達量/MYPT1蛋白表達量。Realtime PCR試劑盒購自美國QIAGEN公司;RhoA活性檢測應用RhoA活性分析試劑盒(NewEast Biosciences，美國)進行，試劑盒內含anti-GTP-RhoA和anti-RhoA抗體;anti-MYPT1和anti-p-MYPT1抗體購自美國Sigma公司。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列表

1.4 統計學分析 應用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以±s表示，兩樣本均數的比較采用t檢驗，多組間均數比較用單因素方差分析檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 辛伐他汀保護大鼠心臟功能 在誘導大鼠冠脈痙攣后，心電圖監測結果在空白對照組，S-T壓低，上下均偏移超過0.9 mV;在他汀組，大鼠心肌功能所受影響不大，S-T壓有輕微的偏移，結果與Rho激酶抑制劑組相似;聯合用藥組，S-T段接近于等電位線，無明顯偏移，提示聯合辛伐他汀和法舒地爾可有效預防大鼠心臟功能。見圖1。

圖1 大鼠冠脈痙攣模型誘導后心電圖改變情況

2.2 Rho激酶mRNA相對表達量 大鼠心臟組織用于提總RNA，real-time PCR檢測Rho激酶mRNA相對表達量。他汀組中Rho激酶基因表達有一定程度下降，但差異無統計學意義(P＞0.05);Rho激酶抑制劑組中Rho激酶基因表達顯著下降，與空白對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，但與他汀組相比差異無統計學意義(P＞0.05);聯合用藥組Rho激酶基因表達顯著減少(P＜0.05)。提示聯合辛伐他汀和法舒地爾可有效降低Rho激酶基因的表達，可能與辛伐他汀能預防大鼠冠脈痙攣相關。見表2。

表2 大鼠用藥后Rho激酶mRNA相對表達量 ±s

表2 大鼠用藥后Rho激酶mRNA相對表達量 ±s

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05

組別 Rho激酶mRNA 相對表達量空白對照組1.00 ±0.00他汀組 0.81 ±0.04 Rho激酶抑制劑組 0.43 ±0.03*聯合用藥組 0.37 ±0.03*

2.3 RhoA蛋白活性和Rho激酶活性 大鼠心臟組織用于提總蛋白，RhoA活性分析試劑盒檢測RhoA蛋白的相對活性，Western blot檢測Rho激酶的相對活性。他汀組和Rho激酶抑制劑組中RhoA蛋白的相對活性和Rho激酶的相對活性均有一定程度下降，但差異無統計學意義(P＞0.05);但在聯合用藥組，RhoA蛋白的相對活性和Rho激酶的相對活性均顯著下降(P＜0.05)，提示兩種藥物可協同作用抑制RhoA/Rho激酶活性，來治療冠脈痙攣大鼠模型。由于Rho激酶的活性是通過其特異性下游底物MYPT1的磷酸化程度來檢測的，Western blot結果也可見p-MYPT1表達在聯合用藥組顯著下降。見表3、圖2。

表3 RhoA蛋白和Rho激酶的相對活性n=10，±s

表3 RhoA蛋白和Rho激酶的相對活性n=10，±s

注:與聯合用藥組比較，*P ＜0.05

組別 RhoA蛋白相對活性 Rho 激酶相對活性他汀組 0.75 ±0.19* 0.68 ±0.16*Rho激酶抑制劑組 0.71 ±0.11* 0.50 ±0.13*聯合用藥組0.52 ±0.13 0.40 ±0.17

圖2 Western blot檢測p-MYPT1和MYPT1蛋白的表達

3 討論

研究表明，他汀類藥物具有降脂、抑制炎性反應、改善內皮功能、抗氧化等多種生理作用，其多效性與RhoA/Rho激酶信號轉導通路關系密切［3］。RhoA是類異戊二烯介質的主要靶點，他汀類藥物通過抑制類異戊二烯的生成而影響Rho的膜定位功能及其對下游效應分子Rho激酶的激活作用［3，4］。已知Rho蛋白是小GTP結合蛋白，控制多重生物信號途徑，在血管平滑肌細胞的增殖、細胞形態的維持、平滑肌的細胞收縮、細胞的黏附以及血小板集聚方面發揮著重要作用。Rho激酶是一種分子量約為160 kD的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Rho激酶有ROCK1和ROCK2兩種異構體;Rho激酶主要存在于細胞漿及細胞核，是調節細胞運動的重要激酶之一，Rho激酶的過度激活或高表達均可引起疾病的產生［5，6］。在本研究中，我們發現在大鼠冠脈痙攣模型中Rho激酶活性會增高，表明模型構建成功。

已知Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾是一種新型異喹啉磺胺衍生物，可以有效緩解腦血管痙攣，最初主要應用于腦血管疾病。近年來，其相關研究不斷深入，其臨床應用不斷拓展，也被認為是一種新型高效的心血管保護藥物［7］。本研究在建立大鼠冠狀動脈痙攣動物模型前采用辛伐他汀、法舒地爾以及聯合辛伐他汀和法舒地爾處理大鼠，以期通過藥物預防大鼠冠脈痙攣，結果發現辛伐他汀在改變RhoA蛋白的相對活性、Rho激酶的相對活性等方面，其作用效果與法舒地爾組相當，進一步研究顯示，二者聯合用藥加強了對Rho激酶的抑制作用，提示他汀類藥物能夠有效預防冠脈的痙攣，可明顯改善缺血心肌的血供，并提高運動耐力，從而有效降低心臟事件的發生率，與相關研究結果［8－10］一致。

綜上所述，辛伐他汀具有預防冠脈痙攣的作用，并且通過抑制RhoA/Rho激酶活性而作用的，其可能在防治冠脈痙攣方面具有重要的作用。但目前在臨床實踐中他汀類藥物具有預防冠脈痙攣的作用尚沒有得到廣泛的認可，相關的作用機制還有待進一步做深入的研究，相信隨著對其研究的不斷深入，為拓展冠脈痙攣的治療提供新的思路。

1 Silveira AA，Dominical VM，Lazarini M，et al.Simvastatin abrogates inflamed neutrophil adhesive properties，in association with the inhibition of mac-1 integrin expression and modulation of rho kinase activity.Inflamm Res，2013，62:127-132.

2 Zhang Z，Wang M，Xue SJ，et al.Simvastatin ameliorates angiotensin iiinduced endothelial dysfunction through restoration of rho-bh4-enos-no pathway.Cardiovasc Drugs Ther，2012，26:31-40.

3 王高頻，楊雪佳，史曉靜，等.阿托伐他汀抑制內皮細胞Rho/Rho激酶信號通路改善細胞骨架.中華老年心腦血管病雜志，2012，14:752-755.

4 武星，李虹偉，李衛萍，等.Rho激酶與心血管疾病.中國心血管雜志，2011，16:393-395.

5 Ma MM，Li SY，Wang M，et al.Simvastatin attenuated cerebrovascular cell proliferation in the development of hypertension through rho/rho-kinase pathway.J Cardiovasc Pharmacol，2012，59:576-582.

6 Li CB，Li XX，Chen YG，et al.Simvastatin exerts cardioprotective effects and inhibits the activity of rho-associated protein kinase in rats with metabolic syndrome.Clin Exp Pharmacol Physiol，2012，39:759-764.

7 張慧.Rho激酶抑制劑法舒地爾在冠心病中的應用進展.中國心血管病研究，2012，10:708-711.

8 Xiao Y，Liang L，Pan Y，et al.Inhibitory effects of simvastatin on migration and invasion of rheumatoid fibroblast-like synoviocytes by preventing geranylgeranylation of rhoa.Rheumatol Int，2013，33:389-399.

9 Voora D.A transcriptomics-informed genetic association study identifies rhoa in simvastatin-induced low-density lipoprotein cholesterol lowering.Circ Cardiovasc Genet，2013，6:137-138.

10 蔣衛紅，譚麗華，楊侃，等.RhoA/Rho激酶在氟伐他汀對組織因子表達影響中的調控作用.中國動脈硬化雜志，2012，20:117-120.