利拉魯肽對大鼠急性脊髓損傷后神經細胞自噬與運動功能恢復的作用

李昊天，趙興長，孫 平，王繼權，褚 鑫，呂 剛，范仲凱

遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州 121001

利拉魯肽對大鼠急性脊髓損傷后神經細胞自噬與運動功能恢復的作用

李昊天，趙興長，孫 平，王繼權，褚 鑫，呂 剛，范仲凱

遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州 121001

目的探討利拉魯肽注射液(Liraglutide)對急性脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后神經細胞的保護作用及其可能機制。方法54只SD大鼠隨機分成假手術組(Sham組)、脊髓損傷組(SCI組，損傷后立即腹腔注射0.9%氯化鈉注射液50μg/kg)和治療組(Liraglutide組，損傷后立即腹腔注射利拉魯肽50μg/kg)，每組18只，Allen法建立大鼠脊髓損傷模型，于損傷后3 d取脊髓組織，Western blot檢測LC3-Ⅱ、Caspase-3表達，免疫熒光雙標染色觀察神經元自噬表達水平、神經細胞凋亡情況；于損傷后1 d、3 d、7 d分別進行Basso Beattle Bresnahan (BBB)運動評分。結果與Sham組相比，SCI組LC3-Ⅱ、Caspase-3表達、自噬陽性神經細胞數目、神經細胞凋亡數目均增多(P＜0.01)，BBB評分顯著降低(P＜0.01)；Liraglutide組與SCI組相比，LC3-Ⅱ顯著增多，Caspase-3表達降低(P＜0.01)；免疫熒光雙標染色示自噬陽性細胞數目明顯增多(P＜0.01)；神經元凋亡雙標染色法示神經凋亡細胞數目明顯減少(P＜0.01)；BBB評分在3 d與7 d時有顯著提高(P＜0.01)。結論利拉魯肽增強大鼠脊髓損傷后神經細胞自噬，降低凋亡相關蛋白表達，減少神經細胞凋亡，促進大鼠運動功能恢復，對脊髓損傷具有保護作用。

脊髓損傷；利拉魯肽；自噬；凋亡

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后可導致繼發性缺血、缺氧等一系列遲發性神經壞死，由此引發的細胞凋亡是脊髓神經元死亡的主要原因[1]。自噬是在營養缺乏或氧化應激時，細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器、大分子物質的過程，對維持細胞穩態具有重要意義[2]。近年來研究表明，SCI后細胞自噬水平顯著提高，對細胞凋亡有復雜的作用與影響[3]。胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是主要由遠端回腸等的L細胞分泌的一種腸促胰島素，通過胰高血糖素樣肽1受體(glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R)產生作用[4]。利拉魯肽是由丹麥諾和諾德公司研發的長效GLP-1類似物，2010年1月被美國食品與藥物管理局(FDA)批準用于成年人2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的治療。近年來，利拉魯肽的胰腺外作用越來越被學者所重視。研究表明，利拉魯肽通過抑制細胞凋亡對腦出血、腦缺血[5-6]、腦部慢性炎癥[7]、阿爾茨海默病[4]等中樞神經系統疾患及胰腺細胞[8]、血管平滑肌細胞[9]的損傷有一定的保護作用，可以通過促進自噬抑制肝細胞和胰腺β細胞的凋亡[10-11]。目前，利拉魯肽在SCI的作用尚未見相關報道。本研究通過利拉魯肽對SCI大鼠模型進行干預，通過檢測神經細胞自噬與凋亡及大鼠運動功能，研究利拉魯肽對脊髓損傷后脊髓神經元的保護作用及其機制。

材料和方法

1材料和試劑 健康成年SD大鼠54只，雌雄不限，體質量(260±30) g，遼寧醫學院實驗動物中心提供。利拉魯肽注射液(18 mg/支，丹麥諾和諾德公司，批號：CP51279)；兔抗大鼠LC3、Caspase-3抗體，小鼠抗大鼠NeuN(美國Abcam生物技術公司)；小鼠抗大鼠β-actin，山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG二抗，FITC標記的驢抗小鼠IgG，Taxes標記的驢抗兔IgG(Santa Cruz)；DAPI，RIPA(美國Sigma公司)；增強型ECL試劑盒(Millipore)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)；TUNEL試劑盒(Roche)。

2動物分組 將大鼠隨機分組為對照組(Sham組，n=18)，脊髓損傷組(SCI組，n=18)，利拉魯肽組(Liraglutide組，n=18)。每組再分為3個亞組(n=6)，第1組應用Western Blot法檢測LC3Ⅱ、Caspase-3含量，第2組應用LC3/NeuN/DAPI/免疫熒光雙標記法、TUNEL法檢測神經細胞自噬及凋亡情況，第3組進行BBB運動評分。Sham組大鼠僅暴露脊髓，其他組制成脊髓損傷模型；根據以往學者對于利拉魯肽在神經系統中的作用以及急性脊髓損傷病理過程的前期研究[1,5,13]，我們制定如下給藥方式：SCI組與Liraglutide組在打擊后分別立即腹腔注射0.9%氯化鈉注射液與利拉魯肽(均為50μg/kg)。

3脊髓損傷模型制備 10%水合氯醛(3.0 ml/kg)腹腔麻醉大鼠，背部備皮消毒，于后背部T10棘突做正中切口，暴露T9、T10棘突及椎板，用咬骨鉗咬除棘突和椎板以暴露脊髓。采用Allen′s法建立脊髓損傷模型[12-13]：擊打器直徑4.0 mm，質量20 g，打擊高度為2.5 cm，致傷能量20 g×2.5 cm，以出現脊髓充血、雙下肢、尾巴痙攣為造模成功，確保每只大鼠達到相同的損傷程度，模型的穩定性與可重復性良好。術后處理：將每只大鼠分籠飼養，食物和飲水不限，室溫維持在(25±1)℃，保持干燥通風。術后定時協助大鼠排尿、排便。

4Western blot檢測LC3、Caspase-3 SCI模型建立后統一于3 d時取脊髓組織。用RIPA裂解液裂解脊髓組織，提取總蛋白，用BCA法測蛋白濃度。制備15% SDS-PAGE進行恒壓電泳，通過濕轉移到PVDF膜上，封閉液室溫封閉1 h，加入LC3、Caspase-3和β-actin抗體，4℃孵育過夜。洗滌后，分別加入HRP標記的山羊抗小鼠及山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，用PBST洗滌，ECL化學發光試劑顯影。

5神經元自噬免疫熒光雙標記染色(LC3/NeuN/ DAPI染色) SCI模型建立后3 d取大鼠損傷脊髓組織，4%多聚甲醛固定1 d，30%蔗糖脫水2 d。在冷凍切片機中包埋后行連續橫行切片(厚5μm)。加正常驢血清封閉1 h。LC3、NeuN兩種一抗按1∶500稀釋混合滴加到切片上，4℃孵育過夜。加入二抗FITC標記的驢抗小鼠IgG與Taxes標記的驢抗兔IgG的二抗混合物(1∶500稀釋)，室溫孵育1 h，再用DAPI染色2 min。在避光條件下于熒光顯微鏡下觀察。對于每段脊髓組織，以打擊點為中心分別向頭尾側延伸2 mm，共取長度為4 mm的脊髓組織進行冷凍切片，每間隔0.5 mm取一張切片，每段脊髓組織取6張切片；對于每張切片在40×10倍視野下隨機選取打擊中心周邊區不重疊的6個視野。計數綠色熒光的NeuN標記與紅色的LC3標記共同定位的自噬陽性細胞數。

6神經元凋亡免疫熒光雙標記染色(TUNEL/NeuN/ DAPI染色) 冷凍切片方法同5。加正常驢血清封閉1 h。NeuN一抗按1∶500稀釋滴加到切片上，4℃孵育過夜。加入二抗FITC標記的驢抗小鼠IgG(1∶500稀釋)，室溫孵育1 h，再按照TUNEL染色試劑盒說明進行操作。再用DAPI染色2 min。在避光條件下于熒光顯微鏡下觀察。切片及選取方法同5。計數綠色熒光的NeuN標記與紅色的凋亡小體標記共同定位的TUNEL陽性細胞數。

7行為學評分 根據文獻報道的方法分別于傷后1 d、3 d和7 d進行BBB評分，研究利拉魯肽對于大鼠SCI的運動恢復作用[14]：將動物置于寬闊活動場地自由活動5 min，觀察其后肢運動情況，分別評分左右兩側肢體，取平均值為每只大鼠的功能得分。由不參與動物分組與治療但熟悉評分標準的2位觀察者同時獨立進行評分，取平均值。

8統計學處理 應用SPSS13.0軟件進行統計學分析。所得數據均以表示，各組均數間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

結 果

1各組LC3-Ⅱ和Caspase-3蛋白表達 Sham組有極少量LC3-Ⅱ；與Sham組相比，SCI組與Liraglutide組LC3-Ⅱ表達量均增多(P＜0.01)；與SCI組相比，Liraglutide組LC3-Ⅱ表達顯著增多(P＜0.01)。Sham組Caspase-3有少量表達，而SCI組與Liraglutide組Caspase-3表達量均增加(P＜0.01)；與SCI組相比，Liraglutide組Caspase-3表達量顯著降低(P＜0.01)。見圖1。

2各組神經元自噬水平比較 DAPI指示細胞核，綠色熒光的NeuN標記指示神經細胞，紅色斑點熒光的LC3標記指示自噬相關蛋白LC3，綠色與紅色熒光共同定位于的細胞為自噬陽性神經細胞。Sham組LC3陽性細胞數少，與Sham組相比，SCI組與Liraglutide組陽性細胞數增多(P＜0.01)；與SCI組相比，Liraglutide組陽性細胞數顯著增多(P＜0.01)，提示自噬水平顯著提高。見圖2。

3各組神經元凋亡數量比較 藍色熒光的DAPI指示細胞核，綠色熒光的NeuN標記指示神經細胞，紅色熒光是TUNEL法指示凋亡小體，綠色與紅色熒光共同定位于的細胞為凋亡神經細胞。與Sham組相比，SCI組與Liraglutide組神經細胞凋亡數量明顯增多(P＜0.01)；與SCI組相比，Liraglutide組神經細胞凋亡數量明顯降低(P＜0.01)。見圖3。

4行為學評分 Sham組在1 d、3 d、7 d的BBB評分分別為18.50±1.18、18.92±0.74、19.42±0.86。SCI組在1 d、3 d、7 d的BBB評分分別為0.91±0.80、1.50±0.44、3.16±0.82；與Sham組相比，SCI組在1 d、3 d及7 d的運動評分均顯著降低(P＜0.01)；Liraglutid組在各個時間點BBB評分分別為1.08±0.66、3.75±0.69、6.17±0.61。與SCI組相比，Liraglutide組在3 d和7 d運動功能評分顯著提高(P＜0.01)。見圖4。

圖 1 Western blot檢測各組LC3-Ⅱ和Caspase-3的表達 (aP＜0.01，與Sham組比較；bP＜0.01，與SCI組比較)Fig. 1 Western blot analysis of LC3-Ⅱ and Caspase-3 protein in different groups (aP＜0.01, vs sham group;bP＜0.01, vs SCI group)

圖 2 各組自噬陽性細胞數(熒光顯微鏡, ×400;aP＜0.01，與Sham組比較；bP＜0.01，與SCI組比較)Fig. 2 Number of autophagy positive neurons in different groups (Fluorescence Microscope, ×400;aP＜0.01, vs sham group;bP＜0.01, vs SCI group)

圖 3 TUNEL檢測各組中神經細胞凋亡情況 (熒光顯微鏡, ×400,aP＜0.01，與Sham組比較；bP＜0.01，與SCI組比較)Fig. 3 Neuronal apoptosis was identified by TUNEL staining in each group (Fluorescence microscope, ×200;aP＜0.01, vs sham group;bP＜0.01, vs SCI group)

圖 4 不同實驗組行為學評分(aP＜0.01，與Sham組比較；bP＜0.01，與SCI組比較)Fig. 4 Behavioral assessment in different groups (aP＜0.01, vs sham group;bP＜0.01, vs SCI group)

討 論

SCI后脊髓神經元的死亡主要由細胞凋亡所致[1,15]。近年來研究表明，自噬與細胞凋亡存在密切的關系[2-3]。自噬是真核細胞的一種高度保守的降解途徑，將蛋白質、生物膜、線粒體、核糖體、內質網及過氧化物酶體等細胞器運送至溶酶體，形成自噬體后被降解為有生物活性的小分子，并重新利用，以維持細胞內環境穩定。在內環境變化(DNA、線粒體損傷)或應激等外界刺激(氧供減少、葡萄糖供應不足、氨基酸缺乏)的條件下可以誘導細胞自噬的發生。Sekiguchi等[16]研究發現，SCI后自噬相關蛋白LC3增高，同時通過雷帕霉素促進自噬可以抑制脊髓神經元凋亡。近來較多研究得出相符結論[3,17]。因此筆者認為通過促進SCI后神經細胞自噬，可能具有抗凋亡作用，為治療脊髓損傷提供新的方法。

GLP-1的生理功能主要是調節胰島素分泌及維持體內葡萄糖代謝，而近年來研究發現，GLP-1受體在嚙齒類動物和心、人腦、脊髓等多種組織中廣泛表達[18]，其胰腺外作用也逐漸被學者所重視。利拉魯肽為長效GLP-1類似物，彌補了外周循環中GLP-1的半衰期短暫的缺點(1 ～ 2 min)，一些研究發現，利拉魯肽對神經系統有一定的保護作用[4-11]，但是利拉魯肽在神經系統中的作用機制尚未闡明。

LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白是由哺乳動物中酵母Atg8基因的同源物編碼的蛋白，參與自噬過程中自噬體的形成。當細胞發生自噬時，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結合，形成LC3-Ⅱ，進而定位于自噬體膜上，其含量的多少與自噬體數目成正比，因此LC3-Ⅱ常用來衡量細胞自噬水平[2]。根據先前學者對于利拉魯肽在神經系統中的研究[5]以及急性脊髓損傷后的病理過程[1,13]，本試驗在建立SCI模型后對每只大鼠立即予以50μg/kg利拉魯肽治療，Western blot法顯示，與Sham組、SCI組相比，Liraglutide組LC3-Ⅱ蛋白表達水平增高；進一步通過免疫熒光雙標染色示Liraglutide組脊髓損傷區域LC3-Ⅱ較另外兩組表達顯著提高。這說明利拉魯肽可以提高SCI后神經細胞的自噬水平。本研究結果與Sharma等[10]發現利拉魯肽通過促進自噬減輕肝細胞脂肪性變、促進肝細胞存活的保護作用相符。同時，Zhou等[11]也指出利拉魯肽可以通過促進自噬抑制膽固醇引發的胰腺細胞凋亡。因此，我們認為利拉魯肽在SCI中的保護作用機制與促進細胞自噬有密切的關系。

SCI導致脊髓氧化應激、炎癥反應、血脊髓屏障破壞、自由基釋放、線粒體內質網功能受損等多方面改變，引起多種促凋亡因子釋放，激活下游凋亡相關蛋白Caspase-3，最終導致細胞凋亡[19]。本研究通過Western blot法研究各組凋亡蛋白Caspase-3的表達，結果顯示，與SCI組相比，Liraglutide組Caspase-3表達顯著減少；進一步應用TUNEL/NeuN雙標染色法發現Liraglutide組神經細胞凋亡數量明顯小于SCI組。以上結果說明利拉魯肽可以有效抑制SCI后神經細胞凋亡。以往研究也得出相符結論：Hou等[6]研究發現，利拉魯肽可以減輕腦出血后的炎癥反應與神經損害；Briyal等[5]指出，利拉魯肽在腦缺血中可以抑制神經細胞凋亡，促進神經功能恢復。我們進一步通過在傷后不同時間進行BBB評分，結果示與SCI組相比，利拉魯肽在傷后3 d與7 d可顯著提高運動功能評分。綜上，筆者認為利拉魯肽可以通過促進自噬從而抑制SCI后神經細胞凋亡，減輕神經損傷。

研究表明，利拉魯肽等GLP-1類似物在神經系統等胰腺外系統中的保護作用機制可能是多方面的。首先，Ogata等[8]與Dai等[9]指出利拉魯肽可以通過抑制線粒體活性氧自由基生成、減輕氧化損傷、保護線粒體功能從而抑制人血管平滑肌細胞與胰腺B細胞的凋亡，說明其神經保護作用可能與保護線粒體功能有關；Parthsarathy和H?lscher[7]指出，利拉魯肽可以減輕大鼠輻射后腦部慢性炎癥，進而改善神經功能；此外，Xiong等[4]發現，利拉魯肽在阿爾茨海默病小鼠模型中有促進記憶能力恢復、減輕退行性病變的作用。

綜上所述，利拉魯肽具有抑制神經細胞凋亡及促進脊髓功能恢復的作用，其可能機制為促進了SCI后神經細胞自噬。本研究為進一步研究及臨床應用奠定基礎，并印證了干預自噬可能成為未來治療SCI的新方法。

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Effect of Liraglutide on neuronal autophagy and movements recovery after spinal cord injury in rats

LI Haotian, ZHAO Xingzhang, SUN Ping, WANG Jiquan, CHU Xin, LYU Gang, FAN Zhongkai
First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

LYU Gang. Email: ganglv_jz@163.com; FAN Zhongkai. Email: flanzz@163.com

ObjectiveTo explore the neuroprotective effect and possible mechanism of Liraglutide in the rat model of spinal cord injury (SCI).MethodsFifty-four SD rats were randomly divided into three groups: sham operation group (n=18), spinal cord injury (SCI) group (immediately received 50μg/kg saline injection intraperitoneally after injury, n=18) and Liraglutide group (immediately received 50μg/kg Liraglutide injection intraperitoneally after injury, n=18). Spinal cord injury model was established using Allen's method. The rats were sacrificed and the spinal cord tissue were taken out 3 days after injury. Western blot was used to analyze the LC3-Ⅱ and caspase-3 expression. Immunofluorescent double labeling was used to detect the autophagy positive neurons and neuronal apoptosis. Finally, behavioral assessment with Basso Beattle Bresnahan locomotor rating scale (BBB) was done at 1 d, 3 d and 7 d after injury.ResultsCompared with sham group, the expression of LC3-Ⅱ, the level of caspase-3 and the number of autophagy positive neurons and neuronal apoptosis increased significantly in SCI group (P＜0.01), while the BBB score decreased significantly (P＜0.01). Furthermore, compared with SCI group, Western blot showed that the expression of LC3-Ⅱincreased while the level of caspase-3 decreased in Liraglutide group (P＜0.01). Immunofluorescent double labeling showed that the number of autophagy positive neurons enhanced significantly (P＜0.01) and the neuronal apoptosis in Liraglutide group reduced significantly compared with SCI group (P＜0.01). Finally, behavioral assessment showed that animals in Liraglutide group achieved significant increase in BBB score on 3 d and 7 d (P＜0.01).ConclusionLiraglutide promotes neuronal autophagy, decreases neuronal apoptosis and improves the locomotor function after SCI. Liraglutide may be a new candidate for clinical application in the treatment of SCI.

spinal cord injury; Liraglutide; autophagy; apoptosis

R 338

A

2095-5227(2015)05-0492-06

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.05.022

時間：2015-02-13 10:07

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150213.1007.004.html

2014-12-01

國家自然科學基金項目(81272074)；遼寧省高等學校優秀人才支持計劃項目(LJQ2014091)；遼寧醫學院校長基金(AH2014012；XZJJ20130204)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (81272074); Program for Liaoning Excellent Talents in University (2014091); Aohongboze Graduate Sci-tech Innovation Foundation, the President Fund of Liaoning Medical University(AH2014012; XZJJ20130204)

李昊天，男，在讀碩士。研究方向：脊髓損傷。Email: lhtlacus@163.com

呂剛，男，主任醫師，教授，博士生導師。Email: ganglv_jz@163.com；范仲凱，男，副教授，碩士生導師。Email: flanzz@163.com