不同取樣方法對骨小梁結構性質分析的影響

尹鵬濱，呂厚辰，張里程，趙 喆，蘇秀云，李 明，張立海，唐佩福

解放軍總醫院 骨科，北京 100853

基礎研究論著

不同取樣方法對骨小梁結構性質分析的影響

尹鵬濱，呂厚辰，張里程，趙 喆，蘇秀云，李 明，張立海，唐佩福

解放軍總醫院 骨科，北京 100853

目的為探究可比性更好、定位更精確的骨小梁取樣方法提供新思路。方法從樣本庫中挑選20個髖關節置換術后股骨頭標本，將性別相同、年齡相差不超過5歲及股骨頭大小相近(直徑相差＜2 mm)的標本配成一對，隨機分為A、B兩組。A組采用標準取樣方法，B組采用傳統取樣方法。對比兩種方法取出骨柱在形態結構、軸心平均偏轉角、密度值變化3方面的差異。結果傳統取樣組骨小梁分布不均、走行各異、小梁間延續性差且斷端較多。對比標準取樣組與傳統取樣組標本在不同旋轉角度下的軸心偏轉角度，前者小于后者(P=0.006)。對比骨密度參數差異，兩組淺層各骨密度參數值均小于改組深層密度參數值，差異有統計學意義；小梁密度均一系數比較，標準取樣組小梁均一系數大于傳統取樣組，骨密度(bone mineral density，BMD)(P=0.000 8)、骨體積分數(bone volumn/trabecular volumn，BV/TV)(P=0.003 4)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)(P=0.000)、骨小梁數量(trabecularnumber，Tb.N)(P=0.002 9)，差異有統計學意義。結論在對比分析不同個體結構、力學性能等方面的差異時，骨小梁取材部位的差異有可能造成人為偏倚，影響實驗結果的準確性和真實性。

骨小梁；骨結構參數；計算機斷層攝影術

隨人口老齡化加劇，骨質疏松及骨性關節炎等骨骼系統退行性疾病發病率日趨升高，給社會及個人帶來嚴重的健康及經濟負擔[1-3]。該類疾病常累及股骨頭，造成該部位骨松質、軟骨下骨等結構發生相應病變[4-5]。利用顯微CT(Micro-CT)等影像學手段，分析股骨頭內特定類型小梁(壓力小梁、張力小梁等)的微觀結構、構成成分、機械性能變化，能夠為該疾病的早期診斷、完善疾病嚴重程度分級及預測骨折等并發癥發病風險提供重要的參考依據[6-9]。由于骨小梁存在各向異性，其分布數量、密度及走行等不盡相同[10-12]。因此，在對比不同個體相應骨小梁病理或生理狀態的變化研究中，精確定位、確保取出相同類型的骨小梁成為首先需要解決的問題。然而，既往研究中利用股骨頭表面解剖結構定位所需骨小梁，由于受股骨頭標本周圍重要解剖標志缺如(如股骨頸、大粗隆等)的制約，難以辨認股骨頭在體空間位置，從而影響小梁定位的準確性[13-15]。因此，在運用這部分小梁結構數據進行疾病分析時，可能造成一定的偏倚，使結果偏離真實值。針對這一問題，現有的研究尚未很好地解決。介于此，我們設計了一種基于CT和三維打印技術實現股骨頭內任意部位骨小梁精確定位取樣的新方案，并以主要壓力小梁取材研究為例，評估傳統直視下壓力小梁取材獲得的骨柱與標準的壓力骨小梁在形態結構、軸心平均偏轉角、密度參數變化3方面的差異，對取材位置引起的誤差進行初步探究與分析，并為獲得可比性更好、定位更精確的骨小梁標本提供新思路。

材料與方法

1標本來源及分組 收集我院骨科2013 － 2014年臨床診斷為骨質疏松性骨折行髖關節置換術后患者的股骨頭樣本。納入標準：術前骨密度T值為-3.0 ～ -2.5。排除標準：1)股骨頭存在先天畸形，或因壞死、腫瘤等骨質疏松疾病以外因素導致股骨頭結構改變者；2)骨折損傷累及股骨頭者；3)服用影響骨代謝藥物者。按照配對設計的原理，將性別相同、年齡相差不超過5歲及股骨頭大小相近(直徑相差＜2 mm)的標本配成一對，隨機分配至標準取樣A組和傳統取樣B組中。每組10個樣本，總計20個樣本。

2個性化取樣模具的制作 股骨頭標本CT掃描：采用0.625 mm層厚，120 kV，740 mA。掃描后(GEDiscoveryCT750HD)，將數據導入Mimics圖像處理軟件(Mimics 17，Materialise，Belgium)[16]。利用該軟件的OnlineReslice功能創建出Interactive MPR，以股骨頭小凹為標記點，通過旋轉十字準星，確定主要壓力小梁最為集中位置所在平面，圖1(A ～ E)。在此平面上建立一個半徑6 mm、高度12 mm圓柱形標記骨小梁取樣部位，使圓柱形CAD對象縱軸與主要壓力小梁平行，且位于上述小梁集中平面的中心。將處理后的圖像導入3matic軟件(3-matic 6.0，Materialise，Belgium)，依據每個股骨頭表面形態，擬合出能精確貼附表面的取樣模具外形；同時，根據圓柱形CAD對象所標記的取樣通道位置和角度信息，確定模具表面取樣通道入口大小、角度及位置，完成模具的設計。將模具文件導入3D打印設備(OBJET EDEN 260V，Stratasys Ltd，Rehovot，Israel)，打印出標準化取樣模具(Transparent Fullcure?720)[17]。

3骨小梁標本取樣 將骨小梁標本取出后恢復至室溫，對標準取樣組，選用與股骨頭標本相對應的標準化取樣模具(圖1F)，在模具準確對合標本后，借助取樣通道的導向作用，引導手術用12 mm無菌環鉆以特定角度鉆入模具定位的取樣區域，獲得骨小梁標本；傳統取樣組，以股骨頭凹作為解剖定位標志估計股骨頭負重區，在小凹上方約5 mm處，指向股骨頭中心，向下取樣。取出的骨小梁標本-80℃保存備用。

圖 1 Mimics軟件下主要壓力小梁精確定位及標準取樣方法取樣A ～ E為主要壓力小梁集中平面取樣通道CAD對象的建立，F為制作完成的取樣模具進行取樣的實例(黃色箭頭所示為股骨頭中心；白色箭頭指示主要壓力小梁取樣；黑色箭頭指示標記的取樣通道)Fig. 1 Principal compressive trabecular location and sampling assisted by mimics software Establishment of CAD labeled the location of principal compressive tracecular was showed in A-E; F showed an example of the standard method to extract principal compressive tracecular (The yellow arrow showing the center of femoral head, the white arrow showing the principle compressive trabecular, and the red arrow showing the sampling channels)

4骨小梁標本顯微CT掃描 將A、B兩組標本恢復至室溫后，置入專用掃描容器中，沿骨柱長軸采用Micro-CT進行掃描(SkyScan1076；Skyscan，Aartselar，Belgium)[18]。掃描參數如下：X線電壓70 kV、電流140 μA、1 mm鋁制濾網，旋轉角度為0.6°/次投影，旋轉180°，圖像以256灰階及18mm像素存儲。每次測量前均采用羥基磷灰石體模進行校準。掃描后數據導入Nrecon軟件(version 1.6.4.1；Skyscan)重建后，采用Ct-Analyzer軟件(version 1.11.8.0；Skyscan)[19]計算相應區域內結構參數。

5軸心偏轉角度測量 定義軸心偏轉角：骨柱旋轉中心軸與壓力小梁走行線之間的夾角(圖2)。順時針旋轉骨柱，間隔30°選擇相應的X線投影，記錄軸心偏轉角(°)，取絕對值后取均值可得單個樣本軸心偏轉角。

6Micro-CT感興趣區域選擇及參數計算 掃描后數據導入Nrecon軟件(version 1.6.4.1；Skyscan)進行重建，并用Ct-Analyzer軟件(version 1.11.8.0；Skyscan)計算標本興趣區域的三維結構信息，在軟骨下皮質骨板下方，沿著骨柱中心線的Z軸，間隔約2 mm(約103張截面圖)，依次選取直徑6 mm，長度2 mm的感興趣區域，每個骨柱選擇8 ～9塊VOI區域分別進行參數運算。計算包括：骨密度值(bone mineral density，BMD)、骨體積分數(BV/ TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁數目(trabecular number，Tb.N)。根據實驗設計，將距皮質2 ～ 10 mm定義為淺層小梁，10 ～ 18 mm定義為深層小梁，計算相應參數的淺層/深層的比值以消除個體差異，提高配對兩樣本間的可比性，評估淺層、深層之間均一系數。

7統計學分析 所有數據均采用SPSS22.0(software 22.0；SPSS，Chicago，IL，USA)軟件進行統計分析。定量數據均采用統計。對所得軸心偏轉角度數據經正態性及方差齊性檢驗后，選用重復測量定量資料的方差分析；對骨微結構參數比較依據正態性及方差齊性檢驗結果，選擇采用成組t檢驗或t’檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1骨小梁標本形態對比 傳統取樣方式骨小梁分布不均、走行各異，與骨柱縱軸呈不同角度；深層小梁較淺層密集，兩者間無明顯過渡區；小梁間延續性差，斷端較多。相較而言，標準取樣組小梁走行均一，與骨柱縱軸平行或呈現較小角度；小梁密集程度隨著距皮質深度增加而逐漸增加，延續性較好。見圖3。

圖 2 軸心偏轉角計算示意圖(axis deflection angle)骨柱旋轉中心軸與壓力小梁走行線之間的夾角，分別計算標本在旋轉0°、 30°、 60°、 90°、 120°、 150°、 180°軸心偏轉角度Fig. 2 Schematic plot showed the measurement of the axis deflection angle Axis deflection angle was measured every 30 degree along the central axis clockwise, namely 0, 30, 60, 90, 120 and 150 degree

圖 3 兩種取樣方法骨小梁結構參數比較距皮質2 ～ 10 mm定義為淺層小梁，10 ～ 18 mm定義為深層小梁Fig. 3 Comparison of bone structural parameters Uniformity coefficient was used to evaluate the uniformity of the extracted trabecular column, and it was defined as the ratio of certain structural parameter from the superior layer (2-10 mm from the cortex) to inferior layer (10-18 mm from the cortex)

2軸心偏轉角度比較 軸心偏轉角為骨柱旋轉中心軸與壓力小梁走行線之間的夾角，用以評價骨小梁標本與壓力小梁走行的一致性。計算標準取樣組與傳統取樣組標本在旋轉0°、30°、60°、90°、120°、150°、180°軸心偏轉角度，比較后發現，傳統取樣組軸心偏轉角度大于標準取樣組(表1)，差異有統計學意義(P=0.006)。

表1 軸心偏轉角對比Tab. 1 Comparison of axis deflection angle

3密度參數變化 分析標準取樣組與傳統取樣組骨微結構參數，兩組骨柱的總體趨勢為隨小梁距皮質深度增加，BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N等值呈現升高趨勢，在接近股骨頭中心位置上述各值達最高。為比較兩者骨微結構參數變化特點，遂距皮質2 ～ 10 mm定義為淺層小梁，10 ～ 18 mm定義為深層小梁，比較淺、深層小梁(表2)BMD(PA=0.000 2，PB=0.000 6)、BV/TV(PA＜0.000 1，PB=0.000 2)、Tb.Th(PA=0.016 4，PB=0.000 1)、Tb.N(PA=0.005 0，PB=0.000 2)值，深層均大于淺層。定義密度均一系數為淺層各骨微結構參數除以深層對應參數所得的數值，對比標準取樣組小梁均一系數與傳統取樣組存在差異(表3)，BMD(P=0.000 8)、BV/TV (P=0.003 4)、Tb.Th(P=0.000 0)、Tb.N(P=0.002 9)，前者大于后者。

表2 各組自身淺深層骨結構參數比較Tab. 2 Comparison of bone structural parameters between superior and inferior layer in each group

表3 密度均一系數比較Tab. 3 Comparison of coefficient of uniformity between two groups

討 論

本實驗發現，由于骨結構存在各向異性，肉眼直視下取材難以保證個體間的準確可比。不同個體在結構、力學性能等方面的差異可能來源于兩方面：一是由于各自病變的程度不同所引起的真實差異；二是由于取材位置不一致引起的實驗誤差。而后者的高低將會直接影響到實驗結果的準確性和真實性。介于此，實驗者設計了一種新型的骨小梁定位取樣方法。此種取樣方法優于現有文獻報道的傳統取樣方法表現在：1)標準取樣方法利用CT數據，實現在三維可視條件下精確定位任意骨小梁，無需依賴股骨頭周邊如大轉子等解剖標志輔助定位，解決了髖關節置換術后標本部分解剖結構缺如以致無法定位的問題。2)利用三維打印技術打印含有取樣通道的標準化取樣模具，實現導向取樣，保證取樣結果與CT定位相符。此種取樣方法目前尚未見有相關報道。

本實驗以主要壓力小梁取材研究為例，評估了傳統直視下壓力小梁取材獲得的骨柱與標準的壓力骨小梁的差異。定義軸心偏轉角為骨柱旋轉中心軸與壓力小梁走行線之間的夾角，用以評價骨小梁標本與壓力小梁走行的一致性。研究發現，傳統取樣組軸心偏轉角度明顯大于標準取樣組標準壓力骨小梁(P=0.006)，表明前者取出骨柱偏離壓力小梁走行區域。骨小梁走行差異主要取決于骨力學分布情況[20-22]。離體股骨頭標本難以進行力學分布判斷，基于表面解剖標志進行判斷，屬經驗性估計結果，較之CT數據下直視定位精確性較差，難以保證取樣準確。另外，取樣過程中，由于缺乏導向工具，鉆取時易出現偏移，使標本偏離壓力小梁，造成軸心偏轉角度過大。

實驗分析了標準取樣組與傳統取樣組Micro-CT掃描獲得的骨微結構參數，結果表明，兩組骨樣均存在一個共同總體趨勢，即隨小梁距皮質深度增加，BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N等值呈現升高的趨勢，在接近股骨頭中心位置上述各值達最高。上述結果與Chiba等[10]對骨微結構異質性的研究結果一致，即骨質疏松患者股骨頭的中心部骨密度參數明顯高于其他部位。該分布特點與股骨頭力學傳導相關，壓力小梁及張力小梁在股骨頭中心部交匯，令該處骨量高于其他部分[23]。

定義密度均一系數為淺層各骨微結構參數除以深層對應參數所得的數值，該數值越大說明小梁均一性越好，即骨柱包含的小梁類型一致。對比標準取樣組小梁均一系數與傳統取樣組存在差異，前者大于后者，說明傳統取樣方式獲得的骨小梁均一性較差，骨柱中除主要壓力小梁外可能還包含其他類型小梁，如非負重區密度值較低的骨小梁，發生了取樣偏離。結合各取樣部位標準差(s)值，傳統取樣組s均高于標準取樣組，說明應用該方法取得的骨柱間自身差異明顯，偏離主要壓力小梁的程度不同。

本實驗存在以下不足：1)樣本數量有限。為減小誤差，實驗開始前，將患者按年齡、骨密度值與股骨頭直徑大小進行配對。基于這樣的要求，使得在樣本庫中進行選擇時難度較大，限制了入組的樣本數量。進一步研究需擴大樣本量，增強結論的說服力；2)缺乏健康人群對照。由于受到倫理學限制，所有樣本均來自骨質疏松癥患者，而缺乏正常健康人的標本作為對照，因而難以判斷實驗結果是否僅適用于骨質疏松患者，對于正常人群是否存在差異不得而知；3)只評價了傳統取樣方法在主要壓力小梁上取樣的結果，對其他類型小梁未進行評估。由于骨小梁取樣存在不可重復性，取樣后可能會破壞其他類型的骨小梁，因而本次實驗僅就主要壓力小梁取樣進行了對比分析，若要進一步評價傳統取樣方式取材位置引起的誤差，需對其他類型骨小梁如張力小梁等進行全面研究。

綜上，傳統直視下壓力小梁取材獲得的骨柱與標準壓力骨小梁在形態結構、軸心平均偏轉角、密度參數變化3方面均存在明顯差異。在對比分析不同個體結構、力學性能等方面的差異時，取材部位的差異有可能造成人為偏倚，影響實驗結果的準確性和真實性。

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Effects of different sampling methods on trabecular structure properties

YIN Pengbin, LYU Houchen, ZHANG Licheng, ZHAO Zhe, SU Xiuyun, LI Ming, ZHANG Lihai, TANG Peifu
Department of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

TANG Peifu. Email: pftang301@126.com

ObjectiveTo provide a novel insight in bone tissue sampling.MethodsTwenty femoral heads were extracted from sample bank of OP patients with femoral neck fracture, and they were matched with the feature of female, age gap less than 5 years and similar size of femoral head (diameter differ less than 2 mm) and were randomly assigned to two groups (A and B). Subchondral bone columns were then extracted from these femoral heads using two different methods (A for standard method while B for conventional method). The morphometric characterization of column specimens, the axis deflection angle and density parameters were compared between two groups.ResultsTrabeculae extracted in conventional way displayed a heterogeneous distribution as long as multiple lacerated ends. The axis deflection angle (ADA, α°) of conventional group was significantly greater than that of standard group (P=0.006). The density parameters in inferior layers were significantly higher than those in superior layers in both groups. The coefficient of uniformity of standard group was significantly better than that of conventional group in bone mineral density (BMD, P=0.000 8), bone / trabecular volumn (BT/TV, P=0.003 4), trabecular thickness (Tb.Th, P=0.000) and trabecular number (Tb.N, P=0.002 9).ConclusionThe inconformity of the spatial position caused by conventional sampling method may affect the evaluation of trabecular microstructure changes, which should be considered as an important experimental bias that will influence the reliability of the results.

bone trabeculae; bone structural parameters; computed tomography

R 68

A

2095-5227(2015)05-0477-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.05.019

時間：2015-01-14 17:19

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150114.1719.002.html

2014-09-24

國家自然科學基金面上項目(31271000)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31271000)

尹鵬濱，男，碩士。研究方向：創傷骨科。Email: yinpe ngbin@gmail.com

唐佩福，男，博士，主任醫師，教授。Email: pftang301 @126.com