縮宮素受體在子宮腺肌癥肌層平滑肌組織中的表達及與痛經的關系

胡小美，關 錚，李 潔，劉愛軍，劉晉紅，范軍振，李亞里

解放軍總醫院，北京 1008531婦產科；2病理科

縮宮素受體在子宮腺肌癥肌層平滑肌組織中的表達及與痛經的關系

胡小美1，關 錚1，李 潔1，劉愛軍2，劉晉紅2，范軍振2，李亞里1

解放軍總醫院，北京 1008531婦產科；2病理科

目的探討子宮腺肌癥(adenomyosis，AM)患者子宮肌層平滑肌組織中縮宮素受體(oxytocin receptor，OTR)的表達水平與痛經程度的關聯性。方法收集2013年9月- 2014年8月在本院婦科因AM行全子宮切除手術的腺肌癥患者50例為腺肌癥組，同期因子宮肌瘤行全子宮切除的患者20例為對照組。應用免疫組化染色法(S-P法)檢測20例正常子宮肌層、50例子宮腺肌癥肌層平滑肌組織中的OTR表達情況。采用光學顯微鏡及Image Plus Pro 6.0圖像分析系統測定OTR水平，并對其差異進行分析。結果AM組子宮肌層平滑肌組織中OTR的表達高于對照組(62 370±34 758 vs 16 082±11 125，P＜0.01)，且表達強度隨著痛經程度的加重而增加，差異均有統計學意義。結論OTR在AM患者子宮肌層平滑肌組織中的表達與痛經程度呈正相關，推測患者痛經形式可能為宮縮痛，表明宮縮強度的增加參與了AM疼痛的發病機制。

子宮腺肌癥；縮宮素受體；子宮肌層；痛經

子宮腺肌癥(adenomyosis，AM)是一類常見的婦科良性疾病，發病機制尚不明確。臨床上主要表現為繼發性進行性加重的痛經，發生率高達64.8% ～ 77.8%[1]。因此，研究AM患者痛經的發病機制并給予相應的治療是緩解及消除患者癥狀的關鍵。目前已有研究發現，痛經與宮腔內壓力的增高及子宮收縮振幅、持續時間、頻率的改變有關[2]；同時，另有研究認為，腺肌癥發病與子宮肌層收縮過強及收縮障礙相關[3]。子宮收縮不僅受雌孕激素介導，前列腺素、縮宮素、血管加壓素及神經遞質類如乙酰膽堿等通過相應的受體也能引起子宮收縮[4]。在這些因素中，縮宮素受體(oxytocin receptor，OTR)是一種重要的收縮相關蛋白，可通過增加平滑肌細胞中的Ca+濃度，引起平滑肌收縮。多數研究表明，OTR在子宮腺肌癥異位病灶中表達增加，且與痛經程度呈正相關[5-6]。本研究旨在通過比較OTR在腺肌癥肌層及正常肌層平滑肌組織中的表達，進一步探討OTR導致痛經的作用機制，明確腺肌癥患者宮縮強度的改變及其與痛經的相關性。

對象和方法

1研究對象 2013年9月- 2014年8月在本院婦科因AM行全子宮切除手術并經病理檢查證實為腺肌癥的患者50例(合并盆腔內異癥、卵巢巧克力囊腫者除外)為腺肌癥組；對照組為同期因子宮肌瘤行全子宮切除的患者20例，不伴有痛經癥狀，并經病理檢查證實均無合并子宮腺肌癥或內異癥。兩組患者均未絕經，且月經周期規律、術前3個月內無性激素用藥史，無內分泌、免疫和代謝性疾病等。

2痛經程度分級 本研究已得到我院倫理委員會的審查通過許可。入選患者均簽署入組知情同意書，且對AM組患者術前行痛經評分調查。根據視覺模擬評分法(visual analogue scale，VAS)，采用中華醫學會疼痛學會監制的VAS卡，卡尺一側附有刻度，以1 cm為間距，兩端分別表示無痛(0)和最劇烈的疼痛(10)，另一側附有與疼痛程度相對應的表情，卡中心有可滑動的游標。患者面對表情面，將游標滑動在痛經時最能代表疼痛程度的部位，醫生面對有刻度的一面，記錄相應疼痛程度。結合患者對疼痛程度的描述，進行疼痛評估：輕度疼痛1 ～ 4分：雖有疼痛但可忍受，并能正常生活、工作，睡眠不受影響；中度疼痛5 ～ 7分：疼痛明顯，不能忍受，睡眠受到干擾，要求使用鎮痛藥，用藥后好轉；重度疼痛8 ～ 10分：疼痛劇烈，不能忍受，睡眠受到嚴重干擾，必須使用鎮痛藥，用藥后疼痛仍不能緩解，可伴有自主神經功能紊亂表現或被動體位。

3標本采集及處理 切除后的全子宮經10%甲醛固定后，選取增厚子宮肌層中不含出血灶的部分，切割成1 cm×1 cm×0.5 cm的標本。常規脫水、石蠟包埋、制成3μm厚切片，行HE染色進一步確診子宮腺肌癥后，另行切片，免疫組化備用；對照組選取同期因子宮肌瘤行全子宮切除的肌層組織。

4OTR水平檢測 采用免疫組織化學方法比較各組患者子宮肌層中OTR的表達。兔抗人OTR多克隆抗體由美國Abcam公司提供，PV-6000通用型試劑盒、DAB顯色試劑盒及封閉用羊血清均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。將石蠟切片常規脫蠟至水，高壓鍋中0.01 mol/L、pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液抗原修復，行羊血清封閉，滴加一抗兔抗人OTR多克隆抗體(1∶20)，置于濕盒內4℃過夜；按照PV-6000二步法免疫組化檢測試劑盒說明添加二抗孵育；DAB顯色、蘇木精復染、脫水透明、中性樹膠封片。用心肌組織作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。每張切片隨機采取5個不包含腺上皮細胞的肌層視野(×200)，采用顯微成像系統(Olympus BX50)拍攝照片，然后利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統對圖片進行分析，分別測量各張切片5個視野的累積光密度值(integral optical density，IOD)，計算各視野的平均值，用表示，用于半定量分析。

5統計學處理 臨床資料采用t檢驗。圖像分析系統所得數據結果經Excel數據庫整理，采用SPSS16.0統計分析軟件進行處理，數據以表示。各組均數比較先進行方差齊性檢驗，表達強度用等級資料，疼痛組與對照組用兩樣本秩和檢驗，子宮腺肌癥無、輕、中、重度疼痛組與對照組間用多樣本兩兩比較秩和檢驗；相關關系采用Spearman等級相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1一般情況 AM組年齡34 ～ 56(45±5)歲，對照組年齡33 ～ 51(44±6)歲。兩組患者年齡、孕產次、體質量指數、月經周期情況及盆腔手術次數比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。入選50例腺肌癥患者中，痛經40例，其中重度痛經20例，VAS分數9.425±0.568；中度痛經10例，VAS分數6.429±0.535；輕度痛經10例，VAS分數3.400±0.516。

2兩組子宮肌層中OTR的表達 AM組及對照組均可見OTR的表達，陽性細胞棕黃色顆粒位于細胞質中(圖1)。AM組中OTR的表達明顯高于對照組肌層中的表達(P＜0.01)。見表1。

圖 1 OTR在子宮腺肌癥肌層和正常子宮肌層中的表達 A：OTR在子宮腺肌癥肌層中的表達(免疫組化，×200)； B：OTR在正常子宮肌層中的表達(免疫組化，×200)； C：子宮腺肌癥病灶(免疫組化，×200)； D：子宮腺肌癥病灶(HE染色，×40)Fig. 1 Expression of OTR in myometrium between AM patients and controls A: OTR expression in AM group (Immunohistochemical image, ×200); B: OTR expression in control group (Immunohistochemical image, ×200); C: ectopic endometrium in AM group (Immunohistochemical image, ×200); D: ectopic endometrium in AM group (HE staining, ×40)

表1 OTR蛋白在子宮腺肌癥肌層和正常子宮肌層中的表達Tab.1 Expression of OTR in myometrium between AMpatients and controls (IOD,±s)

表1 OTR蛋白在子宮腺肌癥肌層和正常子宮肌層中的表達Tab.1 Expression of OTR in myometrium between AMpatients and controls (IOD,±s)

GroupCases (n)IOD±s)P (vs control) Control2016 082±11 125 AM5062 370±34 758＜0.01 Serious2090 545±33 013abc＜0.01 Moderate1068 358±15 750ab＜0.01 Mild1039 823±9 507a＜0.01 No pain1023 003±9 853＜0.01aP＜0.01, vs no pain group;bP＜0.01, vs mild group;cP＜0.05, vs moderate group

3OTR的表達水平與痛經的相關性 隨著痛經程度的增加，OTR的表達有顯著增高趨勢(P＜0.01)，而無痛經組與對照組比較，差異無統計學意義。經相關分析，OTR的表達與痛經程度明顯相關(r=0.860 9，P＜0.01)。

討 論

近年來，子宮腺肌癥的發病率不斷提高，其主要癥狀繼發性痛經已嚴重影響婦女的工作和生活。目前研究認為，AM所致痛經的發病機制有以下幾種可能：子宮平滑肌異常收縮引起的痙攣性疼痛；局部炎癥介質、細胞因子等異常增多，刺激神經纖維痛覺傳導過度以及腺肌癥病灶小囊腔周期性出血至子宮平滑肌張力增大、宮內壓升高引起的高張性疼痛。其中子宮平滑肌收縮引起的疼痛已由分娩時的宮縮痛證明。正常情況下子宮平滑肌會在月經周期的不同時段出現方向不同的子宮收縮蠕動波，而正常的子宮蠕動有利于排卵期精子和受精卵的輸送以及月經期內膜脫落并及時隨血液排出[7-9]。但其蠕動過強則可能出現病理變化，引起患者出現宮縮痛。那么，AM痛經患者是否也存在異常的平滑肌收縮？

OTR是一種典型的G蛋白偶聯受體，在正常的子宮內膜層及肌層中均有表達。在子宮內膜腺上皮細胞中，OT通過與OTR結合，誘導內膜上皮細胞產生PGF2α，PGF2α是傷害感受器及疼痛介質的共激活劑，可通過自分泌或旁分泌的形式促進PGE2及自身的分泌[10]，且兩者均可上調COX-2的表達[11]，而COX-2又可進一步促進PGE2的高表達，導致痛經[4]。已有研究表明，子宮腺肌癥異位內膜腺上皮中，OTR呈高表達，且伴隨痛經程度的增加，OTR的表達有增高趨勢，由此推斷OTR高表達參與了腺肌癥痛經的發病機制，猜測與痛經程度相關[6,12]。而在子宮肌層中，OT/OTR可能參與了子宮收縮的調節機制，體現在OT作用于平滑肌細胞中的OTR，升高細胞內Ca2+濃度，直接刺激平滑肌收縮。那么在腺肌癥病灶周圍的肌層中有無OTR的高表達，從而導致子宮肌層的收縮增強？

本研究通過免疫組織化學方法測定不同痛經程度的腺肌癥患者肌層組織中縮宮素受體的表達，探討腺肌癥子宮有無宮縮強度的改變。結果表明，OTR在腺肌癥組、對照組肌層組織中均有表達，且腺肌癥組明顯高于對照組，差異有統計學意義。此外，通過比較OTR在不同痛經程度組肌層中的表達發現，OTR在重度痛經組積分光密度最高，而在無痛經組及對照組較低，具有顯著統計學差異(P＜0.01)；通過與對照組比較，無痛經組OTR表達積分光密度值高于對照組，但無統計學差異。由此推斷，非痛經者OTR表達相對較低，無宮縮痛；而隨著痛經程度加重，宮縮強度增加，表現為明顯宮縮痛。腺肌癥患者子宮肌層中OTR表達增高，且與患者疼痛的程度明顯相關，推測子宮腺肌癥患者痛經發病機制與宮縮強度增加有關。該結論在其他研究報道中也有提及，Guo等[4]通過Western-Blot方法測定AM痛經患者平滑肌細胞中OTR呈高表達。

綜上所述，OTR在腺肌癥痛經患者子宮肌層中的表達明顯高于非痛經組及對照組，推測子宮平滑肌異常收縮即宮縮強度增加可能是痛經的重要原因。OTR拮抗劑有可能作為一種新藥來緩解子宮腺肌癥引起的疼痛或達到治療目的，期待為臨床尋找治療子宮腺肌癥痛經的保守方法提供理論依據和實驗數據。此外，本實驗尚有不足，目前對疼痛程度的評估沒有統一的標準[13]，實驗中采取的痛經評分方法較主觀；且由于樣本例數較少，此結論有待于進行大樣本、多中心研究，并長期觀察加以證實。

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Expression of oxytocin receptor in smooth muscle of myometrium and its correlation with dysmenorrhea in adenomyosis

HU Xiaomei1, GUAN Zheng1, LI Jie1, LIU Aijun2, LIU Jinhong2, FAN Junzhen2, LI Yali1
1Department of Obstetrics and Gynecology;2Department of Pathology Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

GUAN Zheng. Email: GZ9332@aliyun.com

ObjectiveTo evaluate the expression level of oxytocin receptor (OTR) in smooth muscle of myometrium and its correlation with the degree of dysmenorrhea in adenomyosis.MethodsFifty AM cases and 20 uterine myoma cases admitted to department of gynecology in our hospital from September 2013 to August 2014 were enrolled in this study. Immunohistochemical S-P method was used to identify the expression of oxytocin receptor in smooth muscle of myometrium from 20 cases with pathologically confirmed normal myometrium and 50 female patients with pathologically confirmed adenomyosis. The expression level was detected by using digital image analysis with optical microscope and Image Pro-Plus 6.0.ResultsThe positive expression rates of OTR in smooth muscle of myometrium in AM group were higher than that in controls (62 370±34 758 vs 16 082±11 125, P＜0.01), and the expression level increased with the aggravation of dysmenorrhea. All the differences were statistically significant.ConclusionThe expression level of OTR in smooth muscle of myometrium is positively correlated with the degree of dysmenorrhea. This indicates that the increased intensity of uterine contraction is involved in the pathogenesis of dysmenorrhea.

adenomyosis; oxytocin receptor; myometrium; dysmenorrhea

R 711.74

A

2095-5227(2015)05-0451-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.05.012

時間：2015-02-03 10:32

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150203.1032.001.html

2014-11-02

胡小美，女，碩士。研究方向：子宮腺肌癥痛經的相關因素及子宮內膜息肉的發病機制。Email: huxiaomeigbd@sina.com

關錚，女，博士，主任醫師，教授。Email: GZ9332@ aliyun.com