正交試驗優化乙醇浸提南瓜總黃酮工藝

李會端 ，崔 旭，游 丹

(楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄675000)

1. 引言

黃酮類物質是存在于自然界中的一大類化合物，屬于植物次級代謝產物，是自然界藥用植物中主要活性成分之一。天然植物中提取出的黃酮類物質，經研究證實具有消炎、殺菌;降血壓、降血脂以及清除活性氧自由基等多種生理藥理功能，在食品、醫藥及化妝品工業有廣泛的應用［1-5］。

南瓜富含的人體必需的脂肪酸、氨基酸、生物黃酮、植物甾醇、礦物質、維生素以及多糖等成分，營養價值很高，被公認為特效營養保健食品，具有廣闊的食品開發和應用研究前景。國內外學者對南瓜的營養成分和保健作用已有相關研究報道［6-7］，陳少明報道了《南瓜莖中黃酮類化合物提取工藝的優化》，徐海菊報道了《南瓜葉中總黃酮的提取工藝優化研究》，在文獻中所確定的最佳提取工藝條件下測得南瓜莖和南瓜葉中總黃酮類化合物的含量分別為3.83 mg·g-1和7.08mg·g-1［8-9］。截至目前尚未發現南瓜果實中總黃酮的提取及提取液對羥自由基清除活性的相關報道。作者選用乙醇浸提南瓜果實黃酮，以蘆丁為標準品，通過分光光度法分別測定南瓜皮、南瓜肉和南瓜籽浸提液中的總黃酮含量，并就其提取液對羥自由基的清除能力進行初步探究，分析南瓜果實不同部位黃酮含量的差異，為南瓜營養價值和藥用價值的綜合開發利用提供實驗基礎數據參考。

2. 實驗方法及流程

2.1 原料:南瓜(采購于楚雄市場)→分離→陰干→粉碎→備用。

2.2 實驗方法:黃酮提取液的制備和黃酮類物質的定性實驗，蘆丁標準曲線的繪制及線性方程的獲得，單因素和正交實驗優化提取條件及提取液中總黃酮得率的計算，提取液中總黃酮對羥自由基的清除作用具體操作步驟參考文獻［4，10］，實驗方法及流程如圖1 所示。

圖1 黃酮提取及自由基清除活性探究實驗流程圖Fig.1:The experimental illustration of extraction of flavonoids and radical scavenging effection

3. 結果與討論

3.1 南瓜浸提液黃酮類化合物的顯色反應

對南瓜黃酮的提取操作步驟及提取液的制備，總黃酮的顯色反應參考文獻［4］，顯色反應結果如表1 所示，南瓜浸提液與蘆丁標準液的顯色反應現象一致，說明提取液中含有黃酮類化合物。

表1 總黃酮提取液與蘆丁標準溶液的顯色反應Tab.1 Chromogenic reaction of flavonoids extracts and rutin solution

3.2 繪制標準曲線得線性方程

蘆丁標準溶液的吸收光譜如圖2 所示，故確定510nm 為黃酮類物質的最大吸收波長。根據圖3 所示的蘆丁標準曲線，得線性回歸方程A=0.0001 +5.5536C，R2=0.99908。

圖2 蘆丁標準液和提取液的吸收光譜Fig.2 The absorption spectrum of diagram of rutin and extracts

圖3 蘆丁溶液標準曲線Fig. 3 The standard curve of rutin solution

3.3 南瓜提取液的單因素實驗結果

如圖4 所示，南瓜果實總黃酮浸提的較佳料液比為1∶40 (g·mL-1)，分光光度法測得浸提液中總黃酮提取率最高，分別為2.99% (南瓜肉)，1.77% (南瓜皮)和1.13% (南瓜籽)。

浸提溫度對南瓜果實提取液中總黃酮得率的影響如圖5 所示，低于70℃，黃酮得率隨著溫度的升高而增加，高于70℃，黃酮得率隨著溫度的升高而降低，分析原因可能是溫度過高導致乙醇揮發損耗和溶出速率問題，故確定南瓜總黃酮提取的較佳浸提溫度為70℃，分光光度法測得浸提液中總黃酮得率分別為2.63% (南瓜肉)，1.68% (南瓜皮)和1.13% (南瓜籽)。

圖4 料液比對總黃酮提取率的影響Fig. 4 Effection of solid-liquid ratio on the extraction ratio of total flavonoids

圖5 浸提溫度對總黃酮提取率的影響Fig. 5 Effection of temperature on the extraction ratio of total flavonoids

如圖6 所示，南瓜果實總黃酮提取的較佳浸提時間為2.0h，超過2.0h，隨浸提時間延長總黃酮得率開始降低。浸提時間2.0h 內，測得浸提液中總黃酮得率最高，分別為3.25% (南瓜肉)，1.97 % (南瓜皮)和1.48 % (南瓜籽)。

提取劑乙醇濃度對提取效果的影響如圖7 所示，乙醇濃度為70%時測定南瓜浸提液中總黃酮得率最高，分別為3.05% (南瓜肉)，1.84% (南瓜皮)和1.48% (南瓜籽)。分析原因可能是乙醇濃度為70%更有利于黃酮類化合物從原料中溶出。

圖6 浸提時間對總黃酮提取率的影響Fig. 6 Effection of time on the extraction ratio of total flavonoids

圖7 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.7 Effection of ethanol concentration on the extraction ratio of total flavonoids

根據單因素實驗結果，從乙醇揮發損耗、溶出速率、生產成本和總黃酮得率幾個方面考慮，乙醇浸提南瓜總黃酮的最佳工藝條件為:料液比為1∶40 (g·mL-1)、浸提溫度和時間分別為70℃、和1.5h，提取劑乙醇濃度為70%，所得浸提液中總黃酮得率最高。

3.4 正交實驗結果與分析

在單因素實驗基礎上，以南瓜子浸提液中總黃酮得率為考察指標，選定料液比、浸提時間、浸提溫度和提取劑濃度四個因素，每個因素選定三個水平，設計L9(34)正交實驗表(見表2)，正交實驗結果見表3。

表2 L9 (34)正交實驗因素與水平設計Tab.2 factors and levels of L9 (34)orthogonal experiment

表3 正交實驗結果Tab.3 the result of orthogonal experiment

正交實驗結果顯示，乙醇浸提南瓜籽中總黃酮最優實驗條件組合是A3B1C3D3，在此條件下，南瓜籽浸提液中總黃酮得率高達1.80%。四個單因素的主次關系是D ﹥A ﹥B ＞C，即提取劑濃度是最重要的影響單因素，浸提溫度因素影響最小。在正交實驗確定的最佳提取條件下，即料液比為1.0∶50 g·mL-1，浸提時間為1.5h，浸提溫度為80℃，和提取濃度為80%時，分別浸提南瓜皮、南瓜肉和南瓜籽中總黃酮，做三組平行實驗，分光光度法測得浸提液中總黃酮的得率分別為2.07% (南瓜皮)，3.25% (南瓜肉)和1.80% (南瓜籽)。從表4 結果來看，南瓜果實不同部位黃酮含量分布差異較大。

表4 南瓜浸提液中總黃酮得率Tab.4 extraction ratio of total flavonoids in pumpkin

4. 結果與討論

本論文采用乙醇浸提南瓜果實中的總黃酮，設計單因素實驗與正交實驗，確定了南瓜果實中總黃酮浸提的較佳實驗條件為:料液比1.0∶50 (g·mL-1)，浸提溫度80℃，浸提時間1.5h，提取劑乙醇濃度為80%，在此條件下，測得南瓜果實不同部位浸提液中總黃酮得率分別為2.07%(南瓜皮)，3.25% (南瓜肉)和1.80% (南瓜籽)。與文獻報道的南瓜莖、南瓜葉中總黃酮提取的相關實驗數據對比發現，南瓜葉＞南瓜莖＞南瓜籽，可見南瓜果實中黃酮含量較低，結合本實驗所得數據，南瓜不同部位黃酮含量分布差異較大，而就南瓜果實而言，黃酮含量也不同，南瓜肉＞南瓜皮＞南瓜籽。

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