雙水相氣浮溶劑浮選-紫外分光光度法測定水中痕量氯霉素

趙曉軍，王鈺偉，武大引

(1.平頂山學院 化學化工學院，河南 平頂山 467000;2.河南神馬氯堿發展有限責任公司，河南 平頂山 467000)

氯霉素(CAP)又名氯胺苯醇，是一種廣譜抗生素，用于傳染性疾病如肺炎、傷寒菌痢、百日咳、敗血癥等疾病治療［1］。隨著氯霉素的應用和研究，它的毒副作用也不斷被發現，能夠引起新生兒灰色綜合癥，再生障礙性貧血、粒狀白細胞缺乏癥［2］，但由于藥效高且價格低廉，目前已廣泛應用在家禽、家畜、水產品等傳染性疾病的控制和治療上。由于過度使用，氯霉素在動物性食品及水產品中的殘留對人類的健康構成了潛在危害，所以氯霉素殘留的問題引起了國際組織和許多國家的高度重視。到目前為止，較成熟的檢測方法主要有微生物學方法、免疫速測分析方法、色譜分析方法、光度分析法等。

微生物學方法可大體分為2 種:一種是基于抗生素對微生物生長的抑制作用［3］;另一種是由于微生物對氯霉素敏感而引起生化特性的變化［4-6］，以上這些方法費用低、操作簡單，但特異性差、耗時長、靈敏度低，一般抗生素類藥物都有此類反應，易造成漏檢、錯檢。

由于氯霉素是半抗原，不能刺激機體產生抗體，將氯霉素的二氯酰胺醇和硝基苯結構和大分子蛋白結合后均可作為完全抗原有效制備相應的抗體，在此基礎上建立酶聯免疫競爭法測定氯霉素含量［7-8］。常用的有酶聯免疫吸附法(ELISA)［9-15］、放射免疫法(RIA)［16］、膠體金免疫層析法(GICA)［17-19］、化學發光酶免疫法(CLEIA)［20-22］、伏安免疫法(VIA)［23］等。免疫速測分析技術優點是靈敏度高、分析速度快、儀器簡單，缺點在于對實驗條件的要求較高，易出現假陽性結果，抗體批次不同，測定結果也會出現差異，放射性污染等缺點，其穩定性及敏感性尚待進一步提高。

色譜法具有靈敏度高、結果可靠等優點，是目前國際公認的檢測手段，我國現行國家標準GB/T 22338—2008 規定了動物源性食品中氯霉素類殘留量的氣相色譜-質譜(GC-MS)和液相色譜-質譜(LCMS)測定方法，適用于水產品、畜禽產品和畜禽副產品中氯霉素殘留的定性和定量測定［24］。此外，其他色譜檢測技術，如超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS)用于禽畜肉［25］、蜂蜜［26］、牛奶［27］、奶粉［28］和多種動物源性食品［29］中氯霉素的分析檢測;高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜法(HPLC-ESI-TRAP-MS)用于乳品中氯霉素類藥物殘留的測定［30］;氣相色譜電子捕獲法(GC-ECD)檢測肌肉組織中的氯霉素殘留［31］等。色譜檢測技術具有靈敏度高、準確可靠等優點，但是樣品前處理操作復雜、專業性強、成本較高，不適合進行大批量樣品的快速篩選檢測。

氣浮溶劑浮選技術已廣泛應用于金屬離子檢測［32-34］、有機污染物測定［35-36］、天然產物活性成分的分離［37-38］等。雙水相氣浮溶劑浮選集雙水相體系與溶劑浮選技術的優點，具有操作簡單、成本低、快速、綠色、對環境無污染等特點，該技術用于分離富集氯霉素，具有較強的實際應用價值。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氯霉素標準品(純度99.5%)、磷酸氫二鉀、碳酸鉀、硫酸銨、氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、丙酮、四氫呋喃均為分析純;實驗用水為二次蒸餾水。

UV-2550 雙光束紫外可見分光光度計;UV-1901雙光束紫外可見分光光度計;PHS-3C 型數字酸度計;CP224C 電子天平;LZB-3-13 型玻璃轉子流量計;H1650 離心機(湘儀);自制浮選柱(200 mL)，浮選裝置見圖1。

圖1 雙水相氣浮溶劑浮選裝置Fig.1 ATGS equipment

1.2 實驗方法

1.2.1 雙水相氣浮溶劑浮選 用移液管準確移取一定量的氯霉素工作溶液，于200 mL 的浮選柱中，用一定濃度的析相鹽溶液定容，調節溶液體系的pH，加入5 mL 的正丙醇，靜置分層后，打開氮氣鋼瓶，調節氮氣流速，浮選一定時間，取下層水相，用紫外可見分光光度計測定其吸光度，計算浮選率。

1.2.2 雙水相萃取 取1.2.1 節相同體積的氯霉素及相同濃度的析相鹽溶液200 mL，加入20 mL 正丙醇雙水相萃取，待靜置分層后，取下層水相，用紫外可見分光光度計在278.5 nm 處測定其吸光度，并計算浮選率。

1.2.3 浮選率計算 浮選率(F)按下式進行計算:F=C0－C1/C0，其中C0為浮選(萃取)前水溶液的吸光度，C1為浮選(萃取)后水溶液的吸光度。

2 結果與討論

2.1 親水有機溶劑和析相鹽的選擇

考察了無水乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、丙酮、四氫呋喃等6 種常用的小分子親水有機溶劑，在特定的析相鹽條件下都具有較好的分相能力。而且常溫下其溶液的密度與純水的密度之比＜1，能夠在水溶液上方分相，但四氫呋喃、丙酮微毒且沸點較低，實驗過程中容易揮發，影響實驗的穩定性。無水乙醇/水/硫酸銨、異丙醇/水/硫酸銨雙水相體系，硫酸銨的溶解度隨溫度變化大，分相穩定時間較短，容易析出晶體，阻塞浮選柱砂芯濾板;正丙醇、正丁醇與多數鹽都能形成雙水相體系，但正丁醇在水中的溶解度較小(微溶)，體系范圍較窄，綜合考慮本實驗選擇正丙醇/水/氯化鈉體系。

2.2 檢測波長的選擇

準確稱取0.807 8 g 氯霉素標準品，用蒸餾水溶解于250 mL 的容量瓶中，定容至刻度線，搖勻，配成3.23 mg/mL 的儲備液，放置冰箱備用，用時稀釋成3.23 ×10－2mg/mL 的氯霉素工作溶液。用紫外分光光度計在200 ～500 nm 范圍內掃描，氯霉素吸收光譜見圖2。

圖2 氯霉素吸收光譜Fig.2 Absorption spectrum of CAP

由圖2 可知，氯霉素在278.5 nm 處有最大吸收峰，因此在278.5 nm 處測量上述溶液的吸光度。

2.3 標準曲線的繪制

用移液管準確移取氯霉素工作液1.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，20.00 mL 于25 mL 的容量瓶中，定容，搖勻，分別配成1.29，2.58，5.16，7.74，10.32，12.96，25.84 μg/mL 的氯霉素溶液。在1.29～25.8 μg/mL 范圍內與吸光度呈良好線性關系，回歸方程:A = 0.030 3C + 0.024 4，相關系數R =0.999 0。由IUPAC 定義，檢出限LOD =3SB/b，SB為10 次空白實驗的標準偏差，b 為標準曲線的斜率，可得本實驗對氯霉素的檢出限為0.80 μg/mL。

2.4 氯化鈉的濃度

在6 只200 mL 的浮選柱中分別加入質量分數為2.00，2.50，3.00，3.30，3.60 mg/mL 以及過飽和的氯化鈉溶液，再分別加入5 mL 的正丙醇，考察溶液的分相情況，實驗顯示2.00 mg/mL 的氯化鈉溶液不分相，飽和的氯化鈉溶液分相明顯，相界面清晰?？赡苁菬o機鹽電離出來的陰、陽離子在水化過程中會奪取大量水分子，由于體系中沒有自由水分子，體系就自動生成兩相。

2.5 pH 的影響

用移液管準確移取3.23 ×10－2mg/mL 的氯霉素工作溶液5 mL，于200 mL 的浮選柱中，用飽和氯化鈉溶液定容至200 mL 刻度線處，分別用0.01 mol/L NaOH 溶液或0.01 mol/L HCl 溶液調節溶液體系的pH 值為5，6，7，8，9，10，10.71，11.36，分別加入5 mL 的正丙醇。打開氮氣鋼瓶，調節氮氣流速為一定值，浮選一定時間后，取上層有機相，以正丙醇為參比在278.5 nm 處測定其吸光度，結果見圖3。

圖3 pH 的影響Fig.3 Influence of the pH values

由圖3 可知，pH 值在5 ～11.36 范圍內，吸光度先逐漸變大，然后迅速變小，可能原因是:pH 值的變化影響氯霉素中的羥基、氨基親水基團，使氯霉素的結構更加疏水，利于吸附在上升氣泡上，進入上層有機相，浮選效果更好;但pH 值＞10 左右氯霉素的結構會被破壞。綜上可知，溶液體系的pH 為10 是最佳的浮選條件。

2.6 氮氣流速的影響

用移液管準確移取3.23 ×10－2mg/mL 的氯霉素工作溶液5 mL，于200 mL 的浮選柱中，用飽和氯化鈉溶液定容至200 mL 刻度線處，調節溶液體系的pH 值為10，加入5 mL 的正丙醇。打開氮氣鋼瓶，調節氮氣流速為15，20，25，30，35 mL/min，浮選一定時間后，取上層有機相，以正丙醇為參比在278.5 nm 處測定其吸光度，結果見圖4。

圖4 氮氣流速的影響Fig.4 Influence of the flow rate of nitrogen

由圖4 可知，氮氣流速在15 ～35 mL/min 范圍內，吸光度先增大后略有減小，可能原因是:流速太小，達到平衡所需的時間較長;流速太大，氣泡上升速度快，氯霉素與氣泡接觸時間短，吸附不穩定或已經吸附在氣泡表面的氯霉素脫落重新回到水相。綜上可知，氮氣流速為25 mL/min 是最佳浮選條件。

2.7 浮選時間的影響

用移液管準確移取3.23 ×10－2mg/mL 的氯霉素工作溶液5 mL 于200 mL 的浮選柱中，用飽和氯化鈉溶液定容至200 mL 刻度線處，調節溶液體系的pH 值為10，加入5 mL 的正丙醇。打開氮氣鋼瓶，調節氮氣流速為25 mL/min，分別浮選10，20，30，40，50，60 min 后，取上層有機相，以正丙醇為參比在278.5 nm 處測定其吸光度，結果見圖5。

圖5 浮選時間的影響Fig.5 Influence of the floatation time

由圖5 可知，浮選時間在10 ～60 min，吸光度逐漸增大后略有下降。可能原因是:浮選時間太短，水相中的氯霉素隨著氣泡進入到有機相太少;浮選時間超過40 min 后，時間過長有可能導致氣泡間水膜排水，膜層變薄使得膜層破裂，一些已被浮選至上相的氯霉素，重新回到下層水相，所以40 min 后吸光度略有下降。綜上可知，浮選時間為40 min 是最佳浮選條件。

2.8 共存物質的影響

按實驗方法操作，考察了常見共存離子對測定結果的影響。Cl－、NH4+、NO3－、K+、Na+、SO42－對測定基本無干擾;當相對誤差≤5%時，1 500 倍的淀粉、蔗糖和乳糖，500 倍的果糖、葡萄糖;900 倍的D-色氨酸;600 倍的L-組氨酸;400 倍的甘氨酸;300 倍的抗壞血酸不干擾測定，表明該方法具有較好的選擇性。

2.9 雙水相氣浮溶劑浮選法與雙水相萃取法的對比

雙水相氣浮溶劑浮選法在最佳條件下按1.2.1節方法，計算出浮選率為91.2%;雙水相萃取法按1.2.2 節方法，計算出浮選率為17.08%。證明了雙水相氣浮溶劑浮選法浮選效果要比雙水相萃取法好。

2.10 樣品測定

分別準確移取模擬水樣(樣品1)，某魚塘水(樣品2)各100 mL，魚塘水樣過濾，水樣在2 000 r/min下離心分離15 min，取上層清液，蒸發濃縮至30 mL，用0.45 μm 的濾膜二次過濾，分別按照實驗方法操作，并進行回收率實驗，結果見表1。

表1 樣品中氯霉素含量的檢測及加標實驗結果(n= 5)Table 1 Determination of CAP content in the samples and the results of standard addition

3 結論

本文用雙水相氣浮浮選法測定氯霉素含量，并考察了pH 值、浮選時間、氮氣流速、氯化鈉質量分數等條件對浮選效果的影響，同時對比了雙水相氣浮浮選法和雙水相萃取法的浮選效果。由以上實驗結果可知，析相鹽氯化鈉為飽和溶液時，pH 值為10，氮氣流速為25 mL/min，浮選時間為40 min，雙水相氣浮溶劑浮選法的浮選率為91.2%。

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