HPLC- PAD 法同時(shí)測定維藥祖卡木顆粒中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的含量

買買提·吐爾遜，古麗巴哈爾·達(dá)吾提，陳娟，麥麥提江·熱麥提

(1.喀什大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000;2.新疆特色藥食用植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什 844000)

維吾爾藥祖卡木(Zukamu Granules )顆粒是由山奈、大棗、甘草、睡蓮花、洋甘菊、蜀葵子、薄荷、大黃、破布木果、罌粟殼十種新疆維吾爾天然藥材組成的，采用維吾爾傳統(tǒng)制藥工藝，并結(jié)合現(xiàn)代制藥工藝生產(chǎn)的口服顆粒制劑。該制劑能夠調(diào)節(jié)異常氣質(zhì)，清熱、發(fā)汗、通竅，可用于治療感冒咳嗽、發(fā)熱無汗、咽喉腫痛、鼻塞流涕等病癥［1］。據(jù)古代維吾爾醫(yī)籍記載，該處方至今已有1500 多年歷史。研究表明，組成該處方藥的山奈、大棗、甘草、大黃等都含有黃酮類成分，祖卡木顆粒的抗病毒作用，與其所含有的黃酮類化合物有密切的聯(lián)系。目前，對祖卡木顆粒中總蒽醌、總黃酮、罌粟堿含量的測定有研究報(bào)道，尚未見用高效液相色譜方法同時(shí)分離測定祖卡木顆粒中的甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的相關(guān)報(bào)道。本文以新疆維吾爾藥業(yè)有限公司和新疆齊康哈博維藥有限公司生產(chǎn)的各4 批次祖卡木顆粒為研究對象，提取該顆粒中的甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚，建立用高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定祖卡木顆粒中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚含量的方法。以期為祖卡木顆粒的進(jìn)一步研究和質(zhì)量分析提供一定的參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

甘草苷對照品(編號:111610-201005)、柚皮苷對照品(編號:110722-200610)、槲皮素對照品(編號:100081-200907)、山奈酚對照品(編號:110861-200808)均來自中國藥品生物制品檢定所;甲醇、乙腈均為色譜純;乙醇、磷酸均為分析純;水為高純水;祖卡木顆粒，2013 年和2014 年分5 批采購于喀什及烏魯木齊各大醫(yī)院藥房。

島津LC-20AT 高效液相色譜儀;KQ3200DE 型超聲波清洗器;XA-1 型多功能粉碎機(jī);ZK-82B 真空干燥箱;賽多利斯BS224S 型電子天平。

1.2 色譜條件

色譜柱安捷倫HC-C18 柱(5 μm，250 mm ×4.6 mm)，流動(dòng)相乙腈(A)-0.1% 磷酸(B)，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長286 nm，365 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL 。

1.3 對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取甘草苷、柚皮苷、槲皮素及山奈酚對照品各10.0 mg 置于50 mL 容量瓶中，用甲醇使其溶解并定容至刻度，搖勻，得200 μg/mL 甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚對照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。使用時(shí)根據(jù)需要混合并稀釋至所需濃度。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別準(zhǔn)確吸取不同體積甘草苷、柚皮苷、槲皮素及山奈酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于7 個(gè)10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，在冰箱里保存(5 ℃)。7 組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μg/mL)見表1。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的濃度(μg/mL)Table 1 Concentrations of liquiritin，naringin，quercetin and kaempferol in mixed standard solution

1.4 樣品溶液的制備

取不同廠家不同批次祖卡木顆粒，分別研細(xì)并過60 目篩，準(zhǔn)確稱取粉末1.0 g，用50% 甲醇(50 mL)浸泡2 h 后，超聲提取20 min，使其完全溶解，再次超聲10 min，過濾，并用純甲醇沖洗濾紙，減壓蒸餾至近干，用甲醇定容至25 mL，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液置于冰箱備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

從二極管陣列檢測器采集的樣品三維圖譜中提取紫外光譜和不同波長的色譜進(jìn)行對比，檢測波長為286 nm 時(shí)甘草苷和柚皮苷都有比較強(qiáng)的吸收，而槲皮素和山奈酚吸收較弱。當(dāng)檢測波長為365 nm時(shí)槲皮素和山奈酚都有較強(qiáng)吸收，而甘草苷和柚皮苷吸收很弱或無吸收。因此，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［2-3］確定286 nm (甘草苷、柚皮苷)和365 nm (槲皮素、山奈酚)作為檢測波長。

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別采用不同比例的甲醇/水、乙腈/水、甲醇/磷酸、乙腈/磷酸溶液為流動(dòng)相［4］，對樣品的分離情況進(jìn)行考察，當(dāng)乙腈(A)/0.1%磷酸(B)按下列程序進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚與其他雜質(zhì)峰得到了良好的分離，基線漂移得到了解決，峰形良好。洗脫程序見表2。

表2 洗脫程序Table 2 Elution profile of gradient steps

2.3 提取溶劑及提取方法的選擇

考察了乙醇熱回流索氏提取法、乙醇超聲波提取法、甲醇24 h 浸泡法和甲醇超聲波提取法［5-6］。結(jié)果表明，用50% 甲醇浸泡2 h 后，超聲20 min，放置10 min，再次超聲10 min 的方法對甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的提取率相對最高，在相同的色譜條件下峰面積最大。而且超聲波提取法操作簡便、提取率高。故選擇用50% 甲醇浸泡2 h，超聲20 min，放置10 min，再次超聲10 min 作為提取溶劑和提取方法。

2.4 線性關(guān)系和精密度實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取7 組混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液20 μL，從低濃度到高濃度按色譜條件測定其峰面積，每一組重復(fù)3 次，以對照品濃度c(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表3。

表3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Table 3 Linearity between peak area and concentration

對上述7 組混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中選用甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的濃度為1.0，5.0，5.0，5.0 μg/mL的溶液進(jìn)行了3 次重復(fù)測定，每1 次進(jìn)樣量為20 μL，結(jié)果甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的RSD 分別為2.51%，1.84%，2.07%，1.21%。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(A，B)及樣品溶液(A* ，B* )色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed reference substances(A，B)and samples (A* ，B* )

用乙腈(A)/0.1%磷酸(B)進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，樣品中各組分的色譜峰分離度良好，當(dāng)選擇波長為286 nm 時(shí)，甘草苷、柚皮苷的峰面積最大(見圖A 和A*)。而槲皮素和山奈酚在286 nm 處吸收很弱，因此，選用365 nm 作為槲皮素和山奈酚的檢測波長。此時(shí)，槲皮素和山奈酚的峰面積最大(見圖B 和B*)。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，在12 h 內(nèi)每隔2 h 進(jìn)樣一次，進(jìn)樣量20 μL，測定甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.18%，1.43%，1.98%，2.06%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚含量的祖卡木顆粒樣品5 份，每份1 g 左右，分別添加不同量的甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4 節(jié)方法制備加標(biāo)樣品溶液，按規(guī)定的色譜條件進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表4。其平均回收率為甘草苷102.8%，柚皮苷97.3%，槲皮素103.6%，山奈酚101.4%。

表4 方法的回收率和精密度Table 4 Recovery and precision of the method

2.7 樣品含量測定結(jié)果

精密吸取不同批次不同廠家生產(chǎn)的祖卡木顆粒樣品溶液20 μL 進(jìn)樣，并按1.2 節(jié)色譜條件進(jìn)行測定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的含量，測定結(jié)果見表5。

表5 樣品中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的測定結(jié)果Table 5 Determination results of samples

由表5 可知，樣品2 不同批次的藥品溶液中甘草苷的含量普遍較高，而樣品1 中柚皮苷、槲皮素、山奈酚的含量普遍高于樣品2。

3 結(jié)論

甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚是祖卡木顆粒中的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗菌、祛痰、止咳、平喘等作用，本文對樣品中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的提取方法及色譜條件進(jìn)行了研究，用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測法對不同廠家生產(chǎn)的祖卡木顆粒中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，在同一廠家生產(chǎn)的不同批次樣品中個(gè)體差異很小，而不同廠家生產(chǎn)的藥品中上述四種成分的含量有一定差異，可能是因?yàn)橥读媳群驮蟻碓匆鸬牟町?。同時(shí)對方法的精密度、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率等進(jìn)行了考察，結(jié)果表明該方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，適于測定祖卡木顆粒中甘草苷、柚皮苷、槲皮素和山奈酚的含量。

［1］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾分冊［M］.烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1999:175.

［2］ 許棟明，程可建.RP-HPLC 同時(shí)測定溫膽湯中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷和甘草酸［J］.中國中藥雜志，2011，36(1):45-47.

［3］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典［M］.2010 版.第一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:1081.

［4］ 謝強(qiáng)勝，王坤，尹寧寧.RP-HPLC 法測定橘紅丸中甘草苷、柚皮苷、橙皮苷和迷迭香酸［J］.中成藥，2011，33(12):2085-2088.

［5］ 陳晨，張興旺，羅智敏，等.RP-HPLC 法測定不同地區(qū)金露梅中槲皮素和山奈酚［J］.分析試驗(yàn)室，2009，28(12):54-56.

［6］ 張麗賢，周光明，姜蘭芳，等.非離子表面活性劑萃取-高效液相色譜法測定枇杷葉中的綠原酸、槲皮素和山奈酚［J］.食品科學(xué)，2012，33(6):150-153.