部分景天屬植物DNA條形碼引物的篩選

張洋，郝海葉，那冬晨

(山西師范大學生命科學學院，山西臨汾041004)

景天屬(Sedum)植物多為一年生或多年生草本，大多為肉質植物，莖葉多汁液，耐旱性極強，花朵美麗，花色豐富。植株矮小，株高20～50 cm。景天屬在我國共有124種，1亞種，14變種以及1變型，大多數產于熱帶干旱地區，主要野生于巖石地帶、山坡石縫、林下石質坡地、山谷石崖等處。喜光照，適生溫度為15～18℃，部分種耐陰，對土質要求不嚴［1］。喜濕潤，但忌澇［2］，性耐寒，宜于砂壤土生長。

DNA條形碼(DNAbarcoding)是利用DNA片段快速鑒別物種的基因工具，可通過比對一段較短的DNA序列進行物種鑒定。在理論上，這段短序列可以區分并鑒定地球上所有物種。構建DNA條形碼標準數據庫，利用該項技術鑒別己知物種和發現新物種，是目前分子生物學和分類學發展的最新方向［3］。筆者以部分景天屬植物為材料，尋找該屬植物DNA條形碼的適宜引物，為確定該屬植物的DNA條形碼序列、快捷有效地鑒別該屬植物奠定基礎，同時也可促進該屬植物親緣學和化學分類學等的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 佛甲草、八寶景天、華北景天、費菜、垂盆草。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取。分別采摘上述5種植物生長良好的嫩葉，進行葉綠體DNA和核DNA的分步提取［4－6］。所得DNA于－20℃冰箱保存。

1.2.2 引物篩選。參考相關的DNA條形碼通用序列研究資料，結合景天屬植物的形態特征和生理特征，初步選取psbA-trnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS2、matK 作為候選序列(表1)。

表1 候選引物序列

對上述6對候選序列引物進行篩選，并進行PCR反應體系和反應條件的優化。各對引物相應的PCR反應體系見表2，反應條件見表3。其中matK序列需要進行2次PCR擴增，第2次擴增以第1次PCR擴增產物為模板，用同樣的反應條件進行第2次擴增。

表2 PCR反應體系 μl

表3 PCR反應條件

1.2.3 電泳檢測。提取的核DNA和葉綠體DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測;PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 葉綠體DNA序列引物的篩選

2.1.1 psbA-trnH、ropB、rpoC1。研究表明，psbA-trnH、ropB、rpoC1 3對引物均可作為景天屬植物的DNA條形碼引物。3對引物的擴增率都達到100%，擴增產物大小分別為250～450 bp、500 bp 左右、500 ～650 bp，且種間差異明顯，種內差異較小(圖1～3)。

2.1.2 rbcL、matK。研究表明，rbcL、matK 2 對引物不適合作為景天屬植物DNA條形碼的引物。其中rbcL序列的擴增率僅為40%，擴增出來的片段大小在750 bp左右。matK序列經過2次擴增未能檢測到相關產物。

2.2 核DNA序列引物的篩選 ITS2序列PCR擴增率也達到100%，擴增片段大小為700～750 bp(圖4)。

3 結論與討論

(1)該試驗最終在 psbA-trnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS 2、matK 6對引物中成功篩選出3對葉綠體DNA引物對(psbA－trnH、ropB、rpoC1)和1對總DNA引物對(ITS 2)。這4對引物可以進行相互組合，從而能更好地對景天屬植物進行分類。

(2)據文獻記載，ITS2序列大小一般在400～500 bp，而該試驗經過多次重復，結果顯示ITS 2序列大小為700～750 bp;另有文獻顯示一些景天科植物中rbcL的擴增率達100%，該試驗進行多次重復，擴增率均不超過40%。以上差異之處還有待于進一步深入研究。

［1］那冬晨，任彩琴，柴婷婷，等.華北景天葉片有機滲透調節物質對水分脅迫的響應［J］.北方園藝，2011(17):96 －98.

［2］那冬晨，王文斗，楊麗靜，等.水分脅迫對華北景天葉片結構和葉綠素含量的影響［J］.安徽農業科學，2011，39(26):15902 －15903，15912.

［3］王歡歡，郭春景，張興，等.輻射八寶景天ISSR遺傳多樣性分析［J］.北方園藝，2010(9):149－151.

［4］李春霞，李宏飛.CTAB法高效提取蘋果葉片DNA的研究［J］.北方園藝，2009(2):49－52.

［5］郝海葉，張洋，那冬晨.景天屬植物葉綠體DNA與核DNA分步提取方法研究［J］.安徽農業科學，2013，41(25):10230 －10231.

［6］王文斗，段英俊，那冬晨.植物總 DNA提取方法的改進［J］.安徽農業科學，2013(24):9913，9923.