柞蠶性信息素合成相關基因的表達研究

侯 洋，張 芳，王 郡，胡 飛，劉彥群，魏兆軍*

(1.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽合肥230009;2.沈陽農業大學生命科學技術學院，遼寧沈陽113001)

柞蠶(Antheraea pernyi)屬于大型經濟昆蟲，起源于我國，由于其蠶體較大、易于操作、對光照敏感，長期以來一直是研究光周期、神經內分泌調控等方面很好的模式昆蟲。性信息素首先在家蠶中被鑒定出來［1］，大約1 600種蛾的性信息素和引誘劑被化學鑒定出來［2］。目前已經明確部分性信息素的生物合成路徑［3－5］。Vogel等［6］從煙芽夜蛾性腺的 cDNA文庫中鑒定70個在性信息素生物合成路徑中起作用的候選基因，包括乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、去飽和酶、脂肪酰基還原酶、醛還原酶、醇氧化酶、乙酰基轉移酶、酰基酯酶、脂肪酶等基因。乙酰輔酶A羧化酶屬于類型Ⅰ生物素包含酶，在生物體內催化乙酰輔酶A形成丙二酰輔酶A［7］。超長鏈脂肪酸是指生物體內碳鏈中碳原子數超過18個，在生物體中具有廣泛的生理功能，參與甘油酯、生物膜膜脂及鞘脂的合成［8］。醇脫氫酶是生物體內重要的氧化還原催化劑之一，在生物體內，很多醇類代謝都通過醇脫氫酶催化完成［9］。脂肪酶隸屬于羧基酯水解酶類，能夠將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酸存在于含有脂肪的動物、植物和微生物組織中。酯酶是水解酶，在信息素合成和消化過程中水解酯類。羧酸酯酶與多種藥物的解毒和代謝有關，并參與脂質運輸和代謝［10］。筆者在前期利用轉錄組學方法，明確了柞蠶性信息素合成相關的基因序列。筆者利用定量PCR的方法，明確柞蠶性信息素合成相關的5個基因的組織分布和發育表達。

1 材料與方法

1.1 材料 柞蠶由沈陽農業大學提供。在冰上解剖柞蠶不同組織，包括性腺、腦、中樞神經系統、中腸、脂肪體和卵巢，不同發育時期的性腺分別是羽化前2 d、羽化當天、羽化后2 d，5個個體作為一個樣品。解剖后的樣品迅速放入－80℃冰箱中保存備用。

1.2 柞蠶組織總RNA的提取 抽提RNA使用RNAiso Plus試劑盒，具體操作參照試劑盒說明進行。總RNA經瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度。

1.3 基因組DNA的去除 去除總RNA中的基因組DNA，使用TaKaRa的Recombinant DnaseⅠ試劑盒，具體操作參照試劑盒說明進行。去除基因組DNA后的RNA經瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度。

1.4 cDNA的合成 分別以柞蠶性腺、腦、中樞神經系統、中腸、脂肪體和卵巢以及不同時期性腺中去除基因組DNA后的RNA為模板，使用TaKaRa的PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒，反轉錄成cDNA。cDNA合成反應體系25μl包括:PrimeScriptTMBuffer 5μl，PrimeScriptTMRTEnzyme Mix I 1.25 μl，Oligo dT Primer(50 μmol/L)1.25 μl，Random 6 mers(100 μmol/L)1.25 μl，RNA 1 μg，加 RNase Free ddH2O 到25 μl。于37℃反應15 min，85℃ 5 s使酶失活。

1.5 引物設計與合成 根據前期測定的柞蠶轉錄組數據，明確與性信息素合成通路相關的主要基因，設計柞蠶與性信息素合成相關基因的定量PCR引物，引物序列見表1。引物設計后交上海生物工程公司合成。

表1 定量PCR引物

1.6 定量PCR 稀釋cDNA樣品，取10μl樣品cDNA溶解到30μl ddH2O中，即將樣品稀釋4倍。用熒光染料SYBR Premix Ex TaqⅡ配制20μl反應體系，包括SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RnaseH Plus)10 μl，primer1(10 pmol)1 μl，primer2(10 pmol)1 μl，模板 cDNA 1 μl，ddH2O 7 μl。在 Bio-RAD Two Color Real-Time PCR Detection System熒光定量PCR儀上進行熒光定量PCR反應，每個反應重復3次。數據分析采用2－△△Ct方法計算基因表達的相對變化。

2 結果與分析

2.1 柞蠶乙酰輔酶A羧化酶基因的表達 柞蠶乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase)基因在不同組織以及不同發育階段的發育表達變化見圖1。由圖1a可知，乙酰輔酶A羧化酶基因的表達量在性腺中最高，與其他組織均有顯著性差異，中腸和脂肪體中的表達量均顯著高于腦、中樞神經系統和卵巢，腦、中樞神經系統和卵巢中的表達量三者之間無顯著性差異。由圖1b可知，性腺中乙酰輔酶A羧化酶基因的表達量隨著雌蛾羽化時間的增加，其表達量顯著增大，其中，羽化當天性腺中的表達量是羽化前2 d的15倍，羽化后2 d性腺中的表達量顯著高于羽化當天，是其3倍。

2.2 柞蠶超長鏈脂肪酸基因的表達 柞蠶超長鏈脂肪酸(very long chain fatty acids)基因在不同組織以及不同發育階段的發育表達變化見圖2。由圖2可知，超長鏈脂肪酸基因的表達量在性腺中最高，顯著高于腦、中樞神經系統、中腸、脂肪體和卵巢，其中，卵巢中的表達量顯著高于中腸，是其表達量的1.6倍，而中腸中的表達量顯著高于腦、中樞神經系統和脂肪體。由圖2b可知，性腺中超長鏈脂肪酸基因的表達量隨著雌蛾羽化的進行，其表達量顯著增大，其中，羽化當天性腺中的表達量是羽化前2 d的4倍，羽化后2 d性腺中的表達量顯著高于羽化當天，是其3倍。超長鏈脂肪酸基因在性腺中高表達，且隨著羽化過程含量顯著提高，可能是因為性腺中減數分裂形成大量配子，需要大量的生物膜，超長脂肪酸能夠參與合成生物膜。

2.3 柞蠶醇脫氫酶基因的表達 柞蠶醇脫氫酶基因(Alco- hol dehydrogenase)在脂肪體中表達量最高(圖3)，與其他組織有顯著性差異，腦、中樞神經系統、性腺、中腸、卵巢之間無顯著性差異。性腺中醇脫氫酶基因的表達量在羽化后2 d表達量最高，顯著高于羽化前2 d和羽化當天的表達量，其中羽化后2 d性腺中的表達量約是羽化前2 d的3倍、羽化當天的23倍;羽化前2 d和羽化當天的表達量之間無顯著性差異。雖然在性腺中表達量與其他組織無顯著性差異，但羽化后2 d性腺顯著高于羽化當天，說明醇脫氫酶基因與性信息素的合成密切相關。

2.4 柞蠶脂肪酶基因的表達 柞蠶脂肪酶(Lipase)基因的表達量在中腸中最高，分別是腦、中樞神經系統、性腺、脂肪體、卵巢的173、138、21、69和67倍;其余5個組織之間均無顯著性差異(圖4)。性腺中脂肪酶基因的表達量隨著羽化時間的增加，表達量顯著增大，其中，羽化當天和羽化后2 d性腺中的表達量是羽化前2 d的5倍，但羽化當天和羽化后2 d性腺中的表達量無顯著性差異。

2.5 柞蠶酯酶基因的表達 柞蠶酯酶(Esterase)基因的表達量在中腸中最高，分別是腦、中樞神經系統、性腺、脂肪體、卵巢的85、9、99、6和21倍;其余5個組織之間均無顯著性差異(圖5)。中腸中的表達量較高可能與酯酶是一種水解酶有關，能夠參與柞蠶中腸中食物的消化和吸收過程。性腺中酯酶基因的表達量在羽化前2 d最高，顯著高于羽化當天和羽化后2 d性腺中的表達量，兩者之間無顯著性差異。其中，羽化前2 d性腺中的表達量是羽化當天表達量的80倍，是羽化后2 d表達量的3倍。

3 結論與討論

該研究采用熒光定量PCR法對柞蠶與性信息素合成相關基因在不同組織以及不同發育時期性腺中的表達量進行分析，其中，乙酰輔酶A羧化酶、超長鏈脂肪酸2個基因在性腺中的表達量顯著高于其他組織;醇脫氫酶、酯酶和脂肪酶3個基因在中腸或脂肪體等組織中的表達量高于性腺。乙酰輔酶A羧化酶基因、超長鏈脂肪酸基因、醇脫氫酶基因、脂肪酶基因4個基因在羽化后2 d性腺中的表達量顯著高于羽化前2 d。酯酶基因在羽化后2 d性腺中的表達量顯著低于羽化前2 d。與性信息素合成相關的基因，需要今后對其功能進行鑒定。下一步擬打算采取RNA干擾等方法，調查這些性信息素合成相關基因的功能。

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