葉子花SSR-PCR體系的優化

魯亞靜，陳 庭，李建友，胡章立，昝啟杰，2，陳濤，*

(1．深圳大學生命科學學院，廣東深圳 518060；2.深圳市野生動物救護中心，廣東深圳 518040；3.深圳市中國科學院仙湖植物園，廣東深圳 518004)

?

葉子花SSR-PCR體系的優化

魯亞靜1，2，3，陳 庭3，李建友3，胡章立1，昝啟杰1，2，陳濤1，3*

(1．深圳大學生命科學學院，廣東深圳 518060；2.深圳市野生動物救護中心，廣東深圳 518040；3.深圳市中國科學院仙湖植物園，廣東深圳 518004)

[目的]優化葉子花SSR-PCR體系。[方法] 以喬木葉子花為材料，通過Touchdown PCR擴增程序和正交試驗，對影響葉子花SSR-PCR體系的引物濃度、TaqDNA聚合酶用量、Mg2+濃度和dNTPs濃度進行優化。[結果]葉子花20 μl SSR-PCR體系的最優條件為引物濃度0.4 mmol/L、TaqDNA聚合酶用量1.5 U、Mg2+濃度1.5 mmol/L、4種dNTPs濃度均為0.15 mmol/L，模板100 ng左右。[結論]該反應體系的擴增條帶清晰、穩定、重復性好，可用于后續葉子花遺傳多樣性分析和種質資源鑒定等研究。

葉子花；正交試驗；SSR；PCR體系優化

葉子花又名三角梅、簕杜鵑、寶巾、九重葛等，為紫茉莉科(Nyctaginaceae)葉子花屬(BougainvilleaComm. ex Juss.)植物。葉子花原產南美洲，其栽培品種苞片、花、葉色彩艷麗，已在熱帶亞熱帶地區廣泛栽種[1]。葉子花栽培品種有300多個，但名種多達500個以上。其形態特征隨各地環境因子的差異變化很大，經典的園藝分類往往難于對栽培品種進行準確鑒定。隨著分子生物學的快速發展，RAPD、ISSR、SRAP等分子標記技術被陸續用于葉子花的遺傳多樣性和親緣關系研究，為栽培品種的鑒定提供了更準確可靠的手段[2-5]。

簡單重復序列(Simple Sequence Repeat, SSR)也稱微衛星DNA，是由1～6個核苷酸為重復單位組成的串聯重復序列。SSR分子標記具有雙親共顯性、單一位點高多態性、試驗結果重復性好等優點，已廣泛應用于植物遺傳多樣性分析、種質資源評價和分子鑒定[6-9]。筆者采用Touchdown PCR擴增程序和正交試驗設計[10-11]，對影響葉子花SSR-PCR的引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、Mg2+濃度和dNTPs濃度進行優化，為后續葉子花SSR分子標記引物開發和遺傳多樣性分析與種質資源鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及處理 供試喬木葉子花(B.arborea)采自廣東省深圳市仙湖植物園葉子花保育與研發基地。采集幼嫩葉片用硅膠進行干燥處理，取適量樣品用磁珠在Fastprep-24組織破碎儀上打磨。采用經典的CTAB法提取總DNA[12]，用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA質量，用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測DNA濃度。

1.2 主要試劑與儀器 主要試劑：DL500 DNA Maker、PCR擴增所用的TaqDNA聚合酶、Mg2+以及dNTPs均購自寶生物工程(大連)有限公司，SSR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

主要儀器：SSR擴增反應在BIO-RAD T100TMThermal Cycler上進行；DYY-8C型垂直電泳儀購自北京六一儀器廠，Gene Genius Bio-imaging system凝膠成像儀購于美國。

1.3 葉子花SSR-PCR體系的優化

1.3.1 正交試驗設計。正交試驗所用引物為Bp3，體系驗證引物為Bp1和Bp2，各引物序列見表1。選用L16(44)正交表，對葉子花SSR-PCR條件進行引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、Mg2+濃度和dNTPs濃度4因素4水平優化試驗(表2)。

表1 不同的葉子花SSR引物

表2 葉子花SSR-PCR體系正交設計

1.3.2 單因素試驗設計。利用正交試驗中16組試驗優化的結果，選出一組結果最佳的濃度組合，以此為基準進行PCR體系單因素試驗。每個因素依照表2進行優化，從而得到葉子花SSR-PCR最優的反應體系。

1.3.3 Touchdown PCR擴增程序。94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，10個循環且每個循環降低0.5 ℃；之后94 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，24個循環；最后72 ℃延伸5 min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 葉子花SSR-PCR體系的正交試驗優化 以喬木葉子花DNA為模板和所參試的引物進行PCR擴增，實現對影響PCR擴增的引物濃度、TaqDNA聚合酶量、Mg2+濃度和dNTPs濃度的4水平正交優化。2次重復試驗的PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。

結果顯示，所參試的引物能成功擴增出預期長度范圍的目標片段。泳道9所擴增出的2條帶亮度相差大；泳道13和泳道15所擴增出的2條帶清晰可見，穩定存在；經多次重復試驗發現泳道13所擴增出的2條帶亮度相當，清晰可見，穩定存在，而泳道15所擴增出的2條帶亮度相差大，會出現1條帶模糊甚至是消失，不能穩定存在。因此，正交試驗的第13組為最佳的濃度組合，由表1可知，該組的引物濃度為0.60 μmol/L,TaqDNA聚合酶濃度為1.00 U/20 μl,Mg2+濃度為3.00 μmol/L以及dNTPs濃度為0.20 μmol/L。

2.2 葉子花SSR-PCR體系的單因素試驗優化 以正交試驗的第13組濃度組合為基準，對影響PCR擴增的引物濃度、TaqDNA聚合酶量、Mg2+濃度和dNTPs濃度進行單因素試驗。圖2為1次試驗PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果。

2.2.1 引物濃度。由圖2可知，隨著正反引物濃度的升高，PCR擴增條帶的亮度呈先上升后下降的趨勢。當正反引物濃度為0.30 μmol/L時，目標條帶不被特異性擴增；當正反引物濃度為0.40 μmol/L時，擴增效果最好；此后，隨著正反引物濃度的升高，形成的二聚體增多，故引物濃度選用0.40 μmol/L。

2.2.2TaqDNA聚合酶量。由圖2可知，隨著TaqDNA聚合酶量的增加，PCR擴增條帶的亮度呈上升趨勢。當TaqDNA聚合酶量為1.00 U時，目標條帶未被特異性擴增；當TaqDNA聚合酶量為2.00 U時，擴增效果最好，之后再增加酶量，擴增效果無太明顯的變化。但從節約試劑和整體的擴增效果考慮，TaqDNA聚合酶量為1.50 U時也能達到預期的效果，因此，理想的TaqDNA聚合酶量為1.50 U。

2.2.3 Mg2+濃度。Mg2+為TaqDNA聚合酶發揮活性所必須的，Mg2+濃度過低或過高都會影響PCR擴增效率。由圖2可知，隨著Mg2+濃度的增加，PCR擴增條帶的亮度呈下降趨勢，故選用1.50 μmol/L Mg2+作為理想的Mg2+濃度。

2.2.4 dNTPs濃度。dNTPs濃度過高時，dNTPs會與Mg2+結合，降低體系中Mg2+濃度，影響TaqDNA聚合酶活性。另外，dNTPs濃度過高也會提升錯誤擴增幾率，出現非特異性產物和拖尾現象。由圖2可知，隨著dNTPs濃度的升高，PCR擴增條帶的亮度呈下降趨勢，故dNTPs濃度選用0.15 μmol/L。

2.3 體系驗證 應用上述所得體系，選用不同葉子花(表3)對所設計的SSR引物(表1)進行擴增，用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，結果顯示擴增條帶清晰，重復性好(圖3)。

綜上所述，葉子花20 μl SSR-PCR體系的最優條件：引物濃度0.4 mmol/L，TaqDNA聚合酶用量1.5 U，Mg2+濃度1.5 mmol/L，4種dNTPs濃度均為0.15 mmol/L，可用于后續SSR引物篩選及分析。

表3 用于SSR-PCR反應體系驗證的葉子花材料

3 結論與討論

SSR分子標記技術基于特異引物PCR，任何影響PCR擴增效果的因子, 如引模板DNA、引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度等，都將影響SSR-PCR體系的建立和優化。正交試驗設計優化PCR反應條件比單因素逐個調整法的效率更高，試驗設計更科學，得出的試驗體系有效范圍寬，穩定性好[11]。Touchdown PCR是一種簡單快速的優化方法，能夠增加擴增反應的特異性、敏感性和產物產量，避免了非特異性產物的出現以及對溫度等長時間的優化或對引物的重新設計[10]。

引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。TaqDNA聚合酶為Mg2+依賴性酶，Mg2+與dNTPs具有拮抗作用，Mg2+濃度過高會降低PCR擴增的特異性，濃度過低影響PCR擴增產量甚至導致PCR擴增失敗。朱世楊等[13]在對水稻SSR-PCR體系進行優化時發現，隨著引物濃度增加，PCR擴增中產生的引物二聚體量也呈增加趨勢，尤其是高濃度下產生最多；Mg2+濃度過高反而抑制了Taq酶的活性,導致擴增產物降低，該研究也發現了類似的趨勢。模板DNA濃度過低影響擴增產量，濃度過高導致擴增條帶拖尾甚至無擴增條帶，黃芳麗等[14]在對芒果SSR-PCR反應體系的優化中發現20 μl 體系中模板DNA濃度為60～100 ng時對擴增結果無顯著影響，Yang等[15]在對人參SSR-PCR反應體系的優化中發現，模板DNA濃度為30～120 ng時對擴增結果無顯著影響[15]。因此，該研究將模板DNA濃度控制在100 ng左右，在得到理想結果的合理范圍內。

該研究最終確定葉子花20 μl SSR-PCR體系的最優條件為引物濃度0.4 mmol/L,TaqDNA聚合酶用量1.5 U,Mg2+濃度1.5 mmol/L,4種dNTPs濃度均為0.15 mmol/L，模板DNA 100 ng左右，可用于后續葉子花SSR分子標記引物開發和遺傳多樣性分析與種質資源鑒定研究。

[1] 陳濤.葉子花[M].北京：中國農業出版社，2008.

[2] CHATTERJEE J,MANDAL A K A,CHAKRABARTY D,et al.Use of RAPD analysis to determine genetic diversity and relationship amongBougainvilleacultivars at intra- and inter-specific levels[J].Horticulture,Environment and Biotechnology,2007,48(1):43-51.

[3] SRIVASTAVA R,SHUKLA S,SONI A,et al.RAPD-based genetic relationships in differentBougainvilleacultivars[J].Crop Breeding and Applied Biotechnology,2009,9:154-163.

[4] 李房英,黃彥晶,吳少華.三角梅種質資源的ISSR分析[J].熱帶作物學報,2011,32(9):1692-1696.

[5] 唐源江,武曉燕,曹雯靜.基于SRAP的葉子花種質資源遺傳多樣性及遺傳關系分析[J].熱帶亞熱帶植物學報,2014,22(2):147-154.

[6] FREEMAN S,WEST J,JAMES C,et al.Isolation and characterization of highly polymorphic microsatellite in tea (Camelliasinensis)[J].Molecular Ecology Notes,2004,4:324-326.

[7] GALLI Z，HALASZ G，KISS E，et al.Molecular identification of commercial apple cultivars with microsatellite markers[J].Hort Science,2005，40：1974-1977.

[8 ] ROUBOS K,MOUSTAKAS M,ARAVANOPOULOS F A.Molecular identification of Greek olive (Oleaeuropaea) cultivars based on microsatellite loci[J].Genet Mol Res,2010,9(3):1865-1876.

[9] 張紅蓮,李火根,胥猛,等.鵝掌楸屬種及雜種的SSR分子鑒定[J].林業科學，2010，46(1):36-39.

[10] KORBIE D J,MATTICK J S.Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification[J].Nature Protocols,2008,3(9):1452-1456.

[11] 楊水云,李續娥,吳明宇，等.正交實驗在PCR反應條件優化中的應用[J].生物數學學報,2005,20(2):202-206.

[12] DOYLE J J,DOYLE J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochemical Bull,1987,19:11-15.

[13] 朱世楊,羅天寬,張小玲,等.水稻SSR-PCR體系的優化[J].安徽農業科學,2009,37(8):3441-3443,3447.

[14] 黃麗芳,雷新濤,姚金勝,等.芒果SSR-PCR反應體系的優化[J].熱帶作物學報,2010,31(3):410-415.

[15] YANG T,MU L,WANG J.Optimizing SSR-PCR system ofPanaxginsengby orthogonal design[J].Journal of Forestry Research,2007,18(1):31-34.

Optimization of SSR-PCR System forBougainvilleaarborea

LU Ya-jing1，2，3，CHEN Ting3，LI Jian-You3， CHEN Tao1，3*

(1．School of Life Sciences, Shenzhen University，Shenzhen , Guangdong 518060；2. Center for Wildlife Animal Rescure and Protection，Shenzhen, Guangdong 518040；3. Shenzhen Fairy Lake Botanical Garden，Shenzhen, Guangdong 518004)

[Objective] The aim was to optimize SSR-PCR system forBougainvilleaarboreaby orthogonal design.[Method] Based on orthogonal design, four levels of four factors (primer,TaqDNA polymerase, Mg2+, dNTPs) have been tested to optimize SSR-PCR reaction system usingBougainvilleaaboreagenomic DNA as template. The amplification was performed with a touchdown program. [Result]The optimized SSR-PCR reaction condition forBougainvilleaarboreawas obtained in a 20 μl system containing 0.4 mmol/L SSR primer, 1.5 UTaqDNA polymerase, 1.5 mmol/L Mg2+, 0.15 mmol/L dNTPs and around 100 ng DNA template. [Conclusion]With clear, stable and repeatable amplification bands, the reaction system can be used for the further studies on genetic diversity and germplasm identification.

Bougainvilleaarborea; Orthogonal design; SSR; PCR system optimization

深圳市科技研發資金項目(JCYJ20120615172425764)；深圳市城管局科研項目(200901)。

魯亞靜(1989-)，女，安徽合肥人，碩士研究生，研究方向：資源植物品質鑒別與安全應用。*通訊作者，研究員，博士，從事資源植物研究與開發。

2015-04-22

S 188

A

0517-6611(2015)17-047-03