鴨疫里默氏桿菌大罐發酵培養條件優化及驗證

王艷+苗立中+付強+莊金秋+沈志強

摘要：為進一步了解鴨疫里默氏桿菌的生長特性，本研究利用改良酵母肉湯培養基運用正交設計的方法，在10L的小型發酵罐中對鴨疫里默氏桿菌各種發酵條件進行了優化。隨后將優化結果在GMP生產車間，利用200L大型發酵罐規模化試生產3批鴨疫里默氏桿菌抗原進行驗證，結果顯示，鴨疫里默氏桿菌活菌數比優化前提高30%，為鴨疫里默氏桿菌產業化奠定了基礎。

關鍵詞：鴨疫里默氏桿菌;發酵條件;大罐發酵

中圖分類號：S858.325.1+2 ? ? ?文獻標識碼：B ? ? ?文章編號：1673-1085（2014）05-0036-04

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer RA）感染是全世界養鴨業的一種主要疾病。該病以病鴨死亡率高、消瘦、胴體淘汰、品質下降等造成巨大經濟損失[1]。迄今為止，該病的防治主要有藥物防治及疫苗接種兩種方法[2]，作為預防鴨疫里默氏桿菌病的有效措施，疫苗正在得到廣泛的應用[3]。在疫苗的制備過程中，菌體的濃度直接關系到疫苗質量的好壞和免疫保護效果。所以改善RA的培養條件，提高有效成分濃度對制苗非常重要。高密度發酵作為近年來新興產業，可有效提高抗原產量和培養基的利用率，大幅度降低生產成本，顯著縮短生產周期，減少勞動強度，提高生產效率[4]，為鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗的生產提供了一種新的有效可行的抗原制備工藝。本研究旨在通過鴨疫里默氏桿菌發酵培養條件優化達到菌液濃度最大化的目的，為研制高效疫苗打好基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?試驗用菌株 ?菌株來源：鴨疫里默氏桿菌JX-2株，血清Ⅱ型，分離自北京金星鴨場病死鴨，并由山東綠都生物科技公司菌種室保存。

1.1.2 ?發酵培養基 ?改良酵母肉湯：大豆蛋白胨5g，水解乳蛋白8g，20%酵母浸液50ml，氯化鈉1.5g，豬胃消化液100ml，加蒸餾水至1000ml;116℃高壓滅菌20min，使用前加入5%馬血清。

1.1.3 ?主要儀器和試劑 ?SBA-40E型雙光束紫外分光光度計（Cecil）;GUJS-10C型和GUJS-200C型發酵罐（鎮江東方生物）;SHZ-82A型氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇中大）;消泡劑;豆油。

1.2 ?方法

1.2.1 ?菌種復蘇 ?取凍干保存的鴨疫里默氏桿菌JX-2株，用2ml馬丁肉湯稀釋、混勻，接種于改良酵母肉湯中，37℃振蕩培養18～24h，取樣劃線接種于改良酵母固體培養基平板，置厭氧罐中，37℃培養18～24h，再挑選符合標準的典型菌落用改良酵母固體培養基進行純培養。

1.2.2 ?發酵細菌種子液的制備 ?用改良酵母肉湯洗下純培養菌落，按2%種子量接種于120ml改良酵母肉湯培養基中，37℃振蕩培養18～24h，經純粹檢驗合格后，4℃保存備用。

1.2.3 ?高密度發酵工藝優化試驗方案設計

1.2.3.1 ?正交試驗 ?運用正交試驗設計[4]的方法，將影響鴨疫里默氏桿菌發酵的條件分為通氣（L/S.L）、轉速（轉/min）、培養基pH值等，并將各條件分別設置3個水平，具體試驗分組見表1。

1.2.3.2 ?發酵 ?上述分組試驗均在37℃條件下，培養基為改良酵母肉湯，分別按照上述試驗條件各自發酵，發酵罐采用10L容量，發酵液為6000ml，分別采集發酵后6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h的發酵液，進行活菌計數及OD450nm值檢測。

1.2.4 ?優化配方和優化工藝在GMP生產車間規模化生產應用 ?根據培養基配方優化和發酵工藝優化結果，在GMP生產車間規模化發酵生產3批鴨疫里默氏桿菌抗原，發酵罐采用200L，發酵液體積為150L，分別采集發酵后6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h和26h發酵液，進行活菌計數和OD450nm值檢測，查看規模化應用效果。

1.2.5 ?發酵液檢測

1.2.5.1 ?活菌計數 ?按中華人民共和國獸藥典2010年版三部進行。即將發酵不同時間樣品分別進行10-1～10-10系列稀釋，然后取合適的稀釋度接種改良酵母瓊脂平板，每個稀釋度接種3個平板，0.1ml/板，置蠟燭罐中，37℃培養24h，進行菌落計數，3個平板上菌落的平均數即為該稀釋度的細菌數，再乘以稀釋倍數即為該菌液的細菌濃度。

1.2.5.2 ?OD450nm值測定 ?取不同發酵時間樣品，應用紫外分光光度計對其OD450nm值進行測定，并記錄數據以進行比較。

2 ?結果

2.1 ?RA JX-2株在發酵不同時間各組CFU測定結果見表2。以108CFU為縱坐標，生長時間為橫坐標，分別繪出RA JX-2株在發酵不同時間的生長曲線（見圖1）。

由表2及圖1可見，正交試驗組別序號2獲得的菌液活菌數最高，在發酵18h可達2.87×1010cfu/ml。此組發酵條件是通氣0.1L/S.L;轉速150r/min;培養基pH值7.4。

2.2 ?RA JX-2株在發酵不同時間各組OD450nm值測定結果見表3。以OD450nm值為縱坐標，生長時間為橫坐標，分別繪出RA JX-2株在發酵不同時間的OD450nm值變化曲線（見圖2）。

由表3及圖2可見，正交試驗組別序號2獲得的菌液濃度最高，在發酵22h，OD450nm值可達6.37，測定結果與菌液活菌數測定結果相一致。

2.3 ?RA JX-2株在發酵不同時間各批次活菌數及OD450nm值測定結果見表4。分別以活菌數及OD450nm值為縱坐標，生長時間為橫坐標，繪出RA JX-2株在發酵不同時間的生長曲線（見圖3、圖4）。

從表4、圖3、圖4可見，20130803批次取得的菌液濃度及活菌數目最高，分別為6.47、2.96x1010cfu/ml，20130801批次和20130802批次取得的菌液濃度及活菌數目分別為6.34、2.92x1010cfu/ml和6.43、2.83x1010cfu/ml。

3 ?分析與討論

3.1 ?利用高密度發酵培養的方式，RA在18h時菌液活菌數達到高峰，較搖床培養到達菌數高峰時間要提前6個小時左右，且活菌數也提高了60%多[5]，由此可見高密度發酵培養的優越性。

3.2 ?從GMP生產車間規模化發酵生產3批鴨疫里默氏桿菌抗原的菌液濃度及活菌數目來看，3批發酵檢測數值非常穩定，獸用生物制品GMP車間利用優化的培養基配方和發酵工藝大規模發酵鴨疫里默氏桿菌的效果和實驗室試驗結果基本相同，可以大規模推廣應用。

3.3 ?根據培養基配方優化和發酵工藝優化結果，在GMP生產車間規模化發酵生產3批鴨疫里默氏桿菌抗原活菌數均達到了280億/ml以上，而優化之前活菌數最高是200億/ml，優化后比優化前提高了約30%，這大大節約了生產成本。

3.4 ?在高密度發酵過程中，我們采用活菌計數及OD450nm值測定2種方法進行培養菌液的菌液濃度測定，以此來確立2種檢測方法的相關性，在以后的生產中可通過測定RA發酵液的OD450nm值來推算其活菌數，這樣不但可以避免活菌計數的繁瑣操作，且可更加及時地得知培養結果，大大提高了生產效率。

3.5 ?本研究通過提高發酵工藝，優化其工藝參數，提高菌體的發酵密度，最終提高產物的生產率，不僅可以減少培養體積，還可以縮短生產周期、提高設備利用率從而降低生產成本，達到提高生產效率的目的。這對工業化發酵生產鴨疫里默氏桿菌抗原提供了理論依據并具有一定實用價值。

參考文獻：

[1] ?Y.M.Saif.禽病學[M].第十二版，北京：中國農業出版社，2012，893-901.

[2] ?蔡家利，蘇小運，唐曉麗，等.鴨傳染性漿膜炎滅活疫苗比較研究[J]. 中國預防獸醫學報，2001，23（4）：270-273.

[3] ?寧玲忠，雷紅宇，胡仕鳳，等.鴨疫里默氏菌病研究進展[J].湖南畜牧獸醫，2013，175（3）：4-5.

[4] ?劉吉山.鴨疫里默氏菌2型制苗菌株的篩選及高密度發酵[D].中國農業大學，2006，1-2.

[5] ?苗立中.副豬嗜血桿菌熒光定量PCR方法建立及其分離株高密度發酵研究[D].吉林大學，2012，46-47.