黃芪甲苷對實驗性糖尿病大鼠肝臟組織的保護作用及其機制研究

韓 冬 田耀輝 白慶嶺

（滄州市中心醫院，河北 滄州 061001）

近年來，隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發病率逐年升高。長期血糖控制不佳往往導致多個組織器官并發癥的發生，包括肝臟組織損傷。隨著病理生理學研究的深入，發現糖脂代謝異常引發氧自由基的大量生成與過剩，而導致的廣泛的氧化應激損傷及繼發的細胞凋亡是糖尿病并發癥發生發展的共同機制之一[1-2]。黃芪甲苷為中藥黃芪的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、降血壓、提高機體免疫力等多種藥理學活性[3-5]，且近年來研究者通過制作糖尿病大鼠模型后實施黃芪甲苷干預研究發現，黃芪甲苷能夠有效降低糖尿病大鼠血糖水平，提高免疫力，并能有效改善腎臟組織并發癥[6-7]，但黃芪甲苷是否對糖尿病大鼠肝臟組織具有保護作用，尚未見研究報道。本實驗將采用高脂高糖飲食飼養8周后腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法誘導制備糖尿病大鼠模型，研究黃芪甲苷對實驗性糖尿病大鼠肝臟組織的保護作用，并探討其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級雄性 Wistar大鼠，200～240g，由河北省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（冀）2008-1-003。于室溫 22～25℃、相對濕度 60%～70%、光照周期12h∶12h的環境中飼養實驗動物并進行動物模型的制備。

1.2 藥物和試劑 黃芪甲苷（成都錦泰和醫藥化學技術有限公司，批號：140523，純度≥98%）；鹽酸二甲雙胍（河北天成藥業股份有限公司，批號：20131126）；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HE、TUNEL染色試劑盒購自北京博奧森生物工程有限公司；STZ購自美國Sigma公司。

1.3 主要儀器 血糖儀（羅氏）；UV-1800型紫外分光光度計（日本島津公司）；卓越310型全自動生化分析儀（武漢精誠偉業醫療設備有限公司）；酶標儀（瑞士Tecan公司）；石蠟切片機（德國SLEE公司）；AL104電子天平（Mettler-Toledo公司）。

2 實驗方法

2.1 造模與分組、給藥 實驗用大鼠經高糖高脂飼料連續喂養8周后，一次性通過腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）60mg/kg破壞胰島β細胞制備糖尿病大鼠模型[8]，分別于24h、72h后檢測空腹血糖水平，穩定在16.7mmol/L以上即認定為造模成功。取100只造模成功的大鼠根據血糖水平分為模型組和黃芪甲苷低、中、高劑量（30、60、120mg/kg）組及鹽酸二甲雙胍（200mg/kg）組[9]，另取20只同齡正常大鼠作為正常對照組。造模成功后，各治療組通過灌胃給藥，每日1次，療程4周，模型組和正常對照組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水。

2.2 指標檢測 治療完成后，測定每組大鼠空腹血糖。每組大鼠隨機選取10只，稱量體重，隨后腹腔注射烏拉坦實施麻醉，開腹經腹主動脈取血，離心取血清，檢測血清中各生化指標，然后取肝臟組織，稱重以計算肝臟指數，稱重完成后置于4%多聚甲醛溶液進行固定，用于制作石蠟組織切片；每組剩余的10只大鼠，經麻醉后開腹取肝臟組織，沖洗干凈后加入適量冷裂解液，研磨勻漿，用于檢測肝臟組織中抗氧化酶活性和丙二醛含量。具體方法如下：

2.2.1 空腹血糖水平檢測 大鼠空腹狀態下由尾靜脈采血，通過血糖儀測定空腹血糖。

2.2.2 血 清 中 ALT、AST、ALP活性的檢測 實施麻醉后，經腹主動脈取血并離心取血清，然后按照試劑盒要求通過生化檢測儀測定各組大鼠血清中ALT、AST、ALP 活性。

2.2.3 肝臟指數的計算及肝臟組織病變的觀察 大鼠麻醉后開腹取肝臟組織，生理鹽水沖洗干凈后稱量肝臟重量，然后計算肝臟指數：肝臟指數（%）=（肝臟重量/體重量）×100%。取稱量完成后的肝組織，行4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（厚度約為 5μm） 和展片，常規HE染色，然后通過光學顯微鏡觀察各組大鼠肝臟組織病理性形態學變化并照相保存。

2.2.4 肝細胞凋亡狀況的觀察及凋亡指數的計算取肝臟組織石蠟切片，按照TUNEL試劑盒操作步驟進行染色并通過光學顯微鏡觀察肝臟組織細胞凋亡狀況（細胞核黃染為陽性著色）。凋亡指數的計算：每張染色切片選取6個視野，計數每個視野中肝細胞總數和陽性著色細胞數，取平均值，然后計算凋亡指數：凋亡指數（%）=（陽性細胞數/肝細胞總數）×100%。

2.2.5 肝臟組織中SOD、CAT活性和MDA含量的檢測 取肝臟組織，加入適量冷裂解液后行研磨勻漿，3000r/min低溫（4℃）離心10min后取上清液，按照試劑盒操作方法，通過紫外-可見分光光度計測定大鼠肝臟組織SOD、CAT活性和MDA含量。

2.3 統計學方法 運用SPSS15.0對實驗數據進行統計分析，以（）表示；計量資料組間均數比較采用單因素方差分析，計數資料應用χ2檢驗；P＜0.05表示差異具有統計學意義，P＜0.01表示具有極顯著差異。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠治療后空腹血糖水平、體重和肝臟指數比較 見表1。

3.2 各組大鼠治療后血清ALT、AST、ALP活性比較見表2。

表1 各組大鼠治療后空腹血糖水平、體重和肝臟指數比較（）

表1 各組大鼠治療后空腹血糖水平、體重和肝臟指數比較（）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2 各組大鼠治療后血清中ALT、AST、ALP活性比較（）

表2 各組大鼠治療后血清中ALT、AST、ALP活性比較（）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 各組大鼠肝臟組織病變情況 正常對照組大鼠肝臟組織結構和肝細胞均未見異常；模型組大鼠肝臟組織呈現肝小葉結構紊亂、肝竇充血水腫、肝細胞空泡變性、胞質著色不均、胞核固縮等明顯的病理性形態學變化；經黃芪甲苷治療4周后，肝臟組織病變明顯改善，其中以高劑量組效果最為顯著。見圖1。

3.4 各組大鼠肝細胞凋亡狀況及凋亡指數比較 正常對照組大鼠肝臟組織僅存在極其少量的凋亡細胞；模型組大鼠肝細胞凋亡數量較正常對照組明顯增高；經黃芪甲苷治療4周后，實驗性糖尿病大鼠肝臟組織細胞凋亡狀況明顯改善，以高劑量組效果最為顯著，見圖2。計算凋亡指數發現，模型組大鼠肝細胞凋亡指數較正常對照組明顯升高（P＜0.01），而經黃芪甲苷中、高劑量治療4周后，實驗性糖尿病大鼠肝細胞凋亡指數顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），見表 3。

3.5 各組大鼠肝臟中 SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量比較 見表4。

4 討論

長期血糖控制不佳的晚期糖尿病患者常伴有多個組織器官的并發癥，其危害往往高于糖尿病本身，是導致糖尿病患者致殘、致死的主要原因，包括肝臟組織并發癥。隨著病理生理學研究的深入，發現糖脂代謝紊亂導致氧自由基大量生成與過剩，引發廣泛的氧化應激損傷及其繼發的細胞凋亡是糖尿病并發癥發生發展的共同病理機制之一[10-11]。Khaki A等[10]研究發現，通過藥物干預糖尿病大鼠體內氧化應激反應能夠抑制糖尿病及其并發癥的進展。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理性形態學變化（HE，×400）

圖2 各組大鼠肝細胞凋亡狀況（TUNEL，×400）

表3 各組大鼠肝組織細胞凋亡指數的影響（）

表3 各組大鼠肝組織細胞凋亡指數的影響（）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動物數（只） 劑量（mg/kg）正常對照組凋亡指數（%）102.1±1.210黃芪甲苷低劑量組 10 30 28.5±6.1黃芪甲苷中劑量組 10 60 22.7±4.0*黃芪甲苷高劑量組 10 120 15.3±3.2**鹽酸二甲雙胍組 10 200 24.9±4.6*模型組 37.4±6.9△△

表4 各組大鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量（）

表4 各組大鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量（）

注：與正常對照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動物數（只）劑量（mg/kg）CAT（U/mg prot）14.1±2.0 SOD（U/mg prot）10 GSH-Px（U/mg prot）正常對照組MDA（nmol/mg prot）19.3±2.9 4.08±0.973.71±0.7910黃芪甲苷低劑量組 10 30 9.7±1.9 14.2±2.6 2.61±0.90 8.62±1.80模型組 9.2±1.5△△ 13.6±2.1△△ 2.46±0.82△△ 9.48±1.65△△黃芪甲苷中劑量組 10 60 10.5±2.2* 14.8±3.0 3.15±0.97* 7.94±1.56*黃芪甲苷高劑量組 10 120 11.8±2.3** 16.5±2.9** 3.46±1.13** 5.73±1.37**鹽酸二甲雙胍組 10 200 10.4±2.0* 14.5±2.7 2.78±0.84 6.48±1.51**

黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，味甘性微溫，具有斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效，為我國傳統中藥品種。黃芪甲苷為黃芪的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、降血壓、提高機體免疫力等多種藥理學活性。鹽酸二甲雙胍是目前常用的降糖口服藥，能夠通過增強胰島素敏感度、促進葡萄糖利用和抑制肝糖原異生，表現出降糖作用，且對糖尿病誘發的肝、腎、血管等并發癥具有抑制作用，所以本研究選擇鹽酸二甲雙胍作為陽性對照藥。

細胞膜在氧自由基的攻擊下極易發生脂質過氧化而生成丙二醛（MDA），所以肝組織中MDA的含量能夠間接反映肝組織氧化應激損傷程度；超氧化物歧化酶（SOD）被稱為機體防御氧自由基損傷的第一道屏障，它能夠催化還原氧自由基生成過氧化氫[12]，并在谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）的催化作用下進一步還原生成對人體無害的水和氧[13]。血清中ALT、AST、ALP活性是臨床上常用的監測肝功能的生化指標，肝細胞膜受損后，導致ALT、AST、ALP迅速釋放入血而使血清中三者活性陡然增高，因此能夠敏感地反映肝功能受損傷程度。

本實驗采用高脂高糖飲食飼養8周后腹腔注射STZ的方法誘導制備的糖尿病大鼠模型，并以鹽酸二甲雙胍為陽性對照藥物進行研究，結果發現，經過黃芪甲苷60、120mg/kg干預4周能夠顯著降低實驗性糖尿病大鼠空腹血糖水平，增加大鼠體重并降低肝臟指數，抑制肝臟組織病變及肝細胞凋亡，且能顯著提高肝臟組織中SOD、CAT活性并降低MDA含量，同時降低血清中ALT、AST活性；黃芪甲苷高劑量能顯著升高模型大鼠肝臟組織中GSH-Px活性，降低血清ALP活性。提示黃芪甲苷對實驗性糖尿病大鼠肝臟組織具有保護作用，其作用機制可能與其能夠有效降低血糖水平、改善抗氧化酶活性、降低氧化應激損傷、改善肝功能有關。除肝臟組織外，長期血糖控制不佳還可能誘發腎臟、心肌、腦等多個組織器官的并發癥，下一步我們將研究黃芪甲苷是否對糖尿病誘發的其他組織器官并發癥具有保護作用。

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