不同精制工藝對復方生血口服液成分及初步藥效的影響

吳曉燕 汪 晶 崔 麗 葛衛紅

（1.南京鼓樓醫院，江蘇 南京 210008；2.江蘇省中醫藥研究院，江蘇 南京 210028）

復方生血口服液系在經典名方當歸補血湯基礎上形成的臨床有效制劑[1]，由黃芪、當歸、白術、黨參、仙鶴草、雞血藤、桑葚7味中藥組成，具有補氣養血、健脾補腎的功效。方中黃芪為君藥，黃芪甲苷為其主要的質控指標，傳統工藝采用醇沉法進行精制[2]，近年來發展了大孔吸附樹脂、超濾、離心、絮凝澄清等新型精制方式[3]。本研究采用醇沉法、絮凝澄清法、超濾法對復方生血水提液進行精制，以藥學及藥效學指標對精制工藝進行評價，為選擇復方生血口服液的精制工藝提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀；Alltech ELSD檢測器；AB105電子分析天平（上海精密儀器有限公司）；天然絮凝澄清劑（山東科陽有限公司）；陶瓷膜超濾器（膜孔徑50nm，膜面積0.1m2，久吾高科有限公司）；C18色譜柱（江蘇漢邦科技有限公司）。

1.2 試劑 乙醇（工業用乙醇）；黃芪甲苷對照品（批號110781-200613，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈為色譜純；純凈水（娃哈哈）；其他試劑均為分析純；注射用環磷酰胺（江蘇恒瑞醫藥，批號：130956）；全自動血細胞分析儀（貝克曼庫爾特LH750）；地榆升白片（成都地奧集團，批號：130703）。

1.3 動物 ICR小鼠，雄性，體重18～22g，動物合格證號：SCXC（滬）2013-0016。

2 研究方法

2.1 采用不同精制工藝制備供試樣品

2.1.1 水提液制備 按序稱取復方生血處方中各飲片，加入10倍量水煎煮提取2次，每次2h，合并煎液，濾過，濃縮至每毫升含有1g生藥，備用。參考文獻[4-7]的方法采用醇沉、絮凝澄清、超濾方法制備供試樣品。

2.1.2 醇沉法 取水提取液1份（相當于1kg生藥量），減壓濃縮至相對密度為 1.10～1.15（50℃），加入95%乙醇使含醇量達到60%，充分攪拌，靜置24h，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至相同體積，備用。

2.1.3 陶瓷膜超濾 取水提取液1份，加水稀釋至每毫升含有0.2g生藥量，離心，上清液倒入儲液罐，連接超濾器進行超濾，超濾至原體積85%時，加入原體積40%的水反復超濾，收集濾液，減壓濃縮至相同體積，備用。超濾工藝參數：膜孔徑200nm，膜面積0.1m2，溫度 25～40℃，操作壓力 0.15～0.2MPa，錯流速度 0.2m/h。

2.1.4 絮凝澄清法 取天然澄清劑A，加少量蒸餾水攪成糊狀，繼續加水攪拌，制得1%黏膠液，雙層紗布過濾，得組分A黏膠液；取天然澄清劑B，加水溶解，制得1%黏膠液，繼續加入1%量醋酸攪拌，溶脹24h，雙層紗布過濾，得組分B黏膠液。取水提取液1份，加水稀釋至每毫升含有0.5g生藥量，加入5%的組分B黏膠液，每隔30min攪拌一次；2h后，加入2.5%的組分A黏膠液，每隔60min攪拌一次，藥液靜置過夜，紗布粗過濾，濾紙過濾，減壓濃縮至相同體積，備用。

2.2 黃芪甲苷含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱C18柱（4.6mm×250mm，5μm），乙腈∶水（32∶68）為流動相，蒸發光散射檢測器檢測，漂移管溫度105℃，載氣流速2.7L/min，流動相流速1.0mL/min。色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含有黃芪甲苷485μg的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取三種不同精制工藝濃縮液20mL，用水飽和正丁醇振搖4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[8]。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液5、8、10、15、20、30μL，注入液相色譜儀，以進樣量的常用對數（X）為橫坐標，峰面積的常用對數（Y）為縱坐標進行回歸分析，得回歸方程為：Y=1.7243X+11.424，r=0.9991（n=6）。結果表明，黃芪甲苷在2.425～14.55μg范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度考察 精密吸取對照品溶液，連續進樣6次，測定黃芪甲苷峰面積，計算黃芪甲苷峰面積RSD為2.28%，結果表明精密度良好。

2.2.6 穩定性考察 取供試品溶液，室溫放置，分別在制備后 2、4、8、12、24h 進樣測定，計算黃芪甲苷的峰面積的RSD為3.13%，表明室溫測定結果穩定。

2.2.7 測定 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定。

2.3 藥效評價

2.3.1 造模 參考文獻[9]，采用化學損傷法，制備小鼠外周白細胞減少模型。小鼠以環磷酰胺100mg/kg腹腔注射，每日1次，連續4d。4d后外周白細胞（WBC）數下降至4×109/L即為造模成功。

2.3.2 分組與給藥 取造模成功的小鼠，按白細胞（WBC）隨機分為6組，每組10只，分別為：模型組，灌胃生理鹽水20mL/kg；陽性藥物組，灌胃地榆升白片（10×臨床日用量/60kg）；水提液組，灌胃生血復方水提液（10×臨床日用量/60kg）；醇沉組，灌胃醇沉供試品溶液（10×臨床日用量/60kg）；超濾組，灌胃超濾供試品溶液（10×臨床日用量/60kg）；絮凝澄清組：灌胃絮凝澄清供試品溶液（10×臨床日用量/60kg）。另取10只正常小鼠為空白對照組，灌胃生理鹽水20mL/kg。各組按上述劑量每日以20mL/kg的容積灌胃給藥1次，連續4d。

2.3.3 指標檢測 末次灌胃給藥1h后，眼眶取血，肝素抗凝，于血細胞分析儀上進行白細胞、紅細胞、血小板含量測定。

2.3.4 統計學方法 所有數據采用SPSS17.0統計軟件處理，計量資料均數用（）表示，采用 t檢驗或秩和檢驗分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

3 研究結果

3.1 不同工藝精制后生血復方中黃芪甲苷含量比較 見表1。

表1 不同工藝精制后生血復方中黃芪甲苷含量比較

3.2 不同工藝精制后生血復方藥效學評價 見表2。

表2 各組小鼠治療后外周血象比較（）

表2 各組小鼠治療后外周血象比較（）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

4 討論

藥學實驗結果表明，醇沉法對黃芪甲苷保留率較高，絮凝澄清其次，超濾較低，可能由于超濾過程中增加了稀釋超濾-濃縮的過程，導致指標性成分有所降低。藥效實驗結果表明，醇沉法、超濾法制備的樣品干預白細胞減少模型小鼠后與模型組相比，外周血白細胞、紅細胞計數均顯著提高（P＜0.05），升高白細胞效果明顯，而絮凝澄清則藥效較差；動物死亡數各組間無顯著性區別。超濾法對黃芪甲苷保留率相對較低，但藥效結果卻好于絮凝澄清，推測由于中藥復方成分復雜，指標性成分可能無法完整體現復方的藥效。綜合分析，醇沉法和超濾法更適合于復方生血口服液的精制。

本研究以黃芪甲苷作為藥學指標，血虛模型小鼠白細胞作為藥效學指標，考察了不同精制方式對復方生血水提取液的影響，結果發現單獨以指標性化學成分來進行評定時，可能不能完整體現不同工藝的區別。在進行中藥復方精制過程中，通過結合藥學及藥效學兩種指標，對復方進行個體化篩選，可更好地體現精制工藝的科學性和合理性。此外，不同的精制方式含有不同的精制原理，對復方中主要活性成分群的影響也不同，其適宜性也不盡相同，本研究僅選取了單一藥學及藥效學指標，不夠全面，后續將展開進一步研究。

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