變性梯度凝膠電泳（D GGE）技術在畜禽糞便厭氧發酵液中的研究進展

王 欣，蘇小紅，郭廣亮，劉 偉，徐曉秋，高德玉

（黑龍江省科學院科技孵化中心，哈爾濱 150090）

變性梯度凝膠電泳技術（DGG E）目前是研究微生物群落的組成、多樣性和動態性最重要的檢測手段之一。傳統的研究方法僅限于對有限的微生物進行培養，然后研究其形態學、生理生化反應等特征。隨著分子生物學技術的發展，科研工作者將目光瞄準在開發微生物資源上，并且采用DGG E技術分析環境中的微生物群落結構，以期發現對環境有用的微生物群落，然后開發微生物制劑。研究發現，微生物群落對有機物質的礦化和氮、硫、磷等物質的移除至關重要［1］。利用DGG E技術探討畜禽糞便厭氧發酵過程中微生物群落的各項指標，能及時反應系統中化學需氧量（COD）、揮發性脂肪酸（V F A）、氨氮、磷等的轉化情況，對以畜禽糞便為原料的厭氧發酵技術和環境科學的發展有著重要的現實意義［2］。

1 DGG E技術的原理及優缺點

1.1 DGG E原理

變性梯度凝膠電泳技術［3］被應用于環境微生物領域已有一定歷史，是基于雙鏈DNA片段在變性梯度膠中不同的遷移速度而產生的不同解鏈行為，將聚合酶鏈式反應（PCR）產物中的長度相同序列不同的DNA標記分離，從而獲得不同的條帶，每個條帶代表一類微生物菌群，條帶的強弱代表菌群的多少，可根據實際情況分析挑選出條帶較亮并具有代表性的片段切割回收［4-5］，并進行測序分析，最終根據所得序列比對并判斷不同條帶所代表的優勢菌群類別［6］。

1.2 DGG E技術優缺點

目前DGG E技術已經廣泛應用于分析環境中的藍細菌、細菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性，DGG E技術不但提供系統中優勢種群信息，而且還能同時分析多個樣品，具有操作簡便和可重復性的優點；然而由于現階段研究手段的局限性，使得DGG E技術也存在許多的問題，關于DGG E技術的優缺點有以下幾點論述。

主要優點：

第一，操作的簡便性。樣品可以不經培養，直接提取樣品的總DNA，然后用細菌特定引物對其16s r DNA的可變區進行PCR擴增，DGG E直接分析擴增產物，然后對其條帶進行切割測序［7］，一般在24h內即可獲得結果。

第二，快速同時對比分析大量樣品。權春善等［8］采用DGG E技術探討了外界刺激對不同退化程度的內蒙古草原土壤微生物多樣性的影響，經DGG E分離獲得微生物群落多樣性的DGG E指紋圖譜表明，土壤經過強酸、超聲波和高溫處理后，其微生物群落多樣性顯著降低，經過強堿、漩渦震蕩處理，其豐富度顯著提高，而經過氧化氫酶的刺激顯著提高了其豐富度。陳美軍等［9］利用DGG E技術研究分析了太湖地區真核微型浮游生物的多樣性，發現不同湖區浮游生物的DGG E指紋圖譜存在顯著差異，表明營養水平低的湖區的浮游生物種類較多，豐富度高。

第三，能跟其他分子生物學技術相結合。近年來，DGG E技術結合FIS H技術研究環境樣品中的微生物群落結構和多樣性是一種非常普遍和有用的手段，它能獲得微生物的質量和數量信息，并能同時分析其空間分布特征［10］。DGG E技術與傳統方法結合，如雜交測序、克隆測序、R T-PCR等，從而為人們認識更多的未知微生物資源提供有利途徑。

另外，DGG E還具有以下特性：突變檢出率高，突變檢出率為99%以上；檢測片段長度可達1kb，尤其適用于100～500 bp的片段；非同位素性，DGG E不需同位素摻入，可避免同位素對人體的傷害；重復性好，但該方法需要特殊的儀器，而且合成帶G C夾的引物也比較昂貴。

主要缺點：

第一，DGG E受影響的因素較多，要想獲得清楚的DGG E圖譜，就要優化許多條件，如無菌操作、預處理、引物的選擇、PCR擴增等條件。

第二，無法準確給出微生物的代謝活性、形態結構、細菌數量、基因表達水平及相互之間關系的信息［11］。

第三，由于現有分子生物學技術的局限性，DGG E不能保證將所有的具有一定差異的DNA片段完全分開，序列不同的DNA分子可能會遷移到凝膠的同一位置，可以考慮與傳統方法結合來解決這一問題。

2 DGG E技術在畜禽糞便厭氧發酵液中的應用

畜禽糞便厭氧發酵液中含有較高濃度的COD、氨氮、磷以及未發酵完全的有機物等營養物質［2］，采用DGG E技術對發酵液中的微生物種群結構的各項指標進行分析，能及時反應系統中化學需氧量（COD）、揮發性脂肪酸（V F A）、氨氮、磷等的轉化情況。目前國內關于畜禽糞便高溫厭氧發酵液的DGG E技術報道較少，因此本文提出一種厭氧發酵液微生物多樣性的DGG E檢測試驗，包括以下幾個步驟［12-13］：

第一，試驗樣品基因組DNA的提取：取500m L發酵料液作為測試樣品，使用DNA提取試劑盒對樣品基因組DNA進行提取。

第二，基因組16S r DNA的PCR擴增：取1uL樣品基因組DNA作為PCR反應的模板，分別采用1μL16S r DNA細菌通用引物P2、P3作為正反向引物，按照M ix配成25μL反應體系，使用PCR擴增儀擴增，PCR反應條件：本試驗反應體系采用降落PCR策略，即：預變性條件 94℃ 5m in，94℃ 45s，60℃ 30s，68℃1m in，循環 20次（每兩個循環降一度），94℃45s，48℃1m in，68℃ 1m in，循環 10 次，最后 68℃延伸 4m in。再用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存，以備后用。

第三，PCR反應產物的變性梯度凝膠電泳分析：經反復試驗，確定本試驗的聚丙烯酰胺凝膠的變化濃度為45%～60%，具體制膠、點樣、染色、照相等操作步驟參照趙興青等人［14-17］的相關文獻。

3 結論與展望

厭氧發酵系統是處理畜禽糞便的有效途徑之一，而發酵液中各種微生物是維持系統穩定運行的關鍵因子，本文分析了DGG E技術的原理及優缺點，將DGG E技術應用到畜禽糞便厭氧發酵液中，可以用來分析不同時期發酵液中不同微生物優勢菌群的種類及數量變化，指導厭氧系統的穩定運行。此外，隨著D EE G技術不斷發展，人們對環境中微生物群落結構的多樣性也有了越來越深刻的認識。目前，能夠描述微生物全部群落結構的單一技術還沒有發現，希望學者能加強這一技術的開發，為沼氣產生的微生物學機理研究奠定理論基礎。

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