十產地人參雙向固體發酵前后皂苷成分變化研究

徐瑤 朱瑩瑩 李軍鴿 李佳美 朱凱 王書凱

【摘 要】 目的：取十個不同產地的人參藥材，分別進行雙向固體發酵，比較發酵前后主要皂苷成分變化。方法：用高效液相色譜法測定發酵前后人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rd、Rg3的含量，找出發酵前后所測皂苷的變化情況。結果：十產地人參藥材主要皂苷含量雖有差異，但發酵后成分變化規律相同。在雙向固體發酵30天后，Rg1、Re、Rb1含量均大幅度下降，Rh1、Rd、Rg3含量均有明顯升高。結論：雙向固體發酵可將普通人參皂苷轉化為Rd及稀有皂苷Rh1和Rg3。

【關鍵詞】 人參皂苷 ?雙向固體發酵 ?成分變化

人參（Panax ginseng C.A.Mey）是五加科植物，一般指的人參藥材為其干燥根和根莖。人參的主要有效成分為人參皂苷，根據苷元的不同分為三類[1]：齊墩果烷型五環三萜皂苷、人參二醇類四環三萜皂苷、人參三醇類四環三萜皂苷。人參皂苷Re、Rb1等在人參中含量很高，而有些人參皂苷在人工栽培的人參中極微量或根本不存在，如人參皂苷Rh1、Rg3、CK等，被稱為稀有皂苷，卻擁有更好的活性，在抗腫瘤、抗衰老、抗炎和保肝等[2]方面表現出了極大的潛力。本實驗對十產地人參通過前期選育得到的靈芝菌進行雙向固體發酵，比較發酵前后人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rd、Rg3的含量變化，為利用該生物轉化手段將主要人參皂苷轉化為稀有皂苷提供有力的佐證。

1 材料與方法

1.1 材料

來源為靖宇縣、撫松縣露水河鎮、撫松縣松江河鎮、撫松縣、長白山、撫松縣泉陽鎮、撫松縣東崗鎮、撫松縣漫江鎮、撫松縣興參鎮和撫松縣萬良鎮已按2010版《中國藥典》方法檢測達標的吉林省十產地人參藥材。

1.2 試劑和儀器

色譜純甲醇、乙腈購自Fisher Scientific;分析純甲醇、磷酸購自北京化工廠;水為杭州娃哈哈集團有限公司產娃哈哈飲用純凈水;人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rd、Rg3對照品購自中國藥品生物制品鑒定所;AB-135S十萬分之一天平;KQ-250B型超聲波清洗器;SORVALL Evolution RC高速離心機;Agilent 1260高效液相色譜儀;YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋;恒溫培養振蕩器（天津市歐若儀表有限公司）;BIC-250型人工氣候箱;DHG7-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.3 人參雙向固體發酵

十產地人參分別粉碎，過1號篩，加入適量的水和生長因子，混勻制成固體培養基，平均分裝于三角瓶中，121℃滅菌60min，放入接種室冷卻至室溫。將已經培養好的靈芝種子液以一定的比例接入瓶裝固體培養基中，放入人工氣候箱中28℃避光培養30天。待菌絲已長滿瓶底，取出，放入55℃烘箱，干燥后即為人參藥性菌質。

1.4 人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rg3、Rh1含量測定

1.4.1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rg3含量測定色譜條件

色譜柱Agilent-SB（4.6×250mm，5μm），流動相：乙腈-0.4%磷酸水梯度洗脫（見表1），柱溫：30℃，流速：1ml/min，檢測波長：203nm。

1.4.2 人參皂苷Rh1含量測定的色譜條件

色譜柱GL Sciences-ODS（4.6×250mm，5μm），流動相：乙腈-水（26.5：73.5），柱溫：30℃，流速：1ml/min，檢測波長：203nm。

1.4.3 對照品溶液的制備

將6種人參皂苷對照品分別以甲醇為溶劑精密配置成0.2mg/ml的溶液。

1.4.4 供試品溶液的制備

取十產地人參及發酵后藥材粉碎，過4號篩，分別精密稱定1.25g，置于錐形瓶中，并精密加入25ml甲醇，密塞稱重后，超聲處理30min，超聲后冷卻補重，離心（8000r/min，20min），取上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得[3]。

1.4.5 含量測定

精密吸取上述制備液各20μl，用高效液相色譜儀進行分析， 每個供試品平行進2針，通過計算得出6種人參皂苷的含量，并對十產地人參雙向固體發酵前后以上成分含量變化進行比較。

2 結果

2.1 十產地人參藥材6種皂苷含量比較

實驗中可知十產地人參藥材中，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rh1、Rd含量差異較大。其中，Rh1含量極微，人參皂苷Rg3幾乎檢測不到。結果分析表明，從靖宇縣人參藥材含二醇類和三醇類四環三萜皂苷量最高，三醇類皂苷（以Rg1、Re作參考）含量可達到其它產地的1.6～2.6倍，二醇類皂苷（以Rb1作參考）含量可達到其它產地的1.6～5.9倍，可見，不同產地人參藥材各成分差異之大。

2.2 十產地人參發酵前后6種皂苷含量變化規律

發酵前后皂苷含量變化各不相同，但呈現出相同的轉化規律：Rg1、Re、Rb1含量均大幅度下降，Rd、Rg3、Rh1含量均有明顯升高（可參考圖1～圖2）。

3 討論

十產地人參雖都產自吉林，但測定結果表明，不同皂苷含量差異甚大。比較十產地人參發酵前后6種皂苷的含量變化發現，Rg1、Re、Rb1含量下降明顯，Rh1、Rd、Rg3含量明顯升高，可以推測原人參藥材中的主要皂苷Rg1、Re、Rb1通過雙向固體發酵的手段發生了轉化。而Rh1、Rd、Rg3含量的增加是與Rg1、Re、Rb1含量的減少有直接或間接關系的，Rg1可直接轉化為Rh1（Rg1C20葡萄糖苷鍵斷裂）[4]，Re可通過Rg1直接或間接轉化為Rh1（ReC6末端的鼠李糖糖苷鍵斷裂轉化為Rg1，Rg1C20上葡萄糖苷鍵斷裂轉化為Rh1）[5，6]，Rb1可通過Rd直接或間接轉化為Rg3（直接水解或相繼水解Rb1C20上的兩個葡萄糖）[7]。稀有皂苷明顯增加，給靈芝菌種對人參藥材的雙向固體發酵研究帶來了更大的研究意義，稀有人參皂苷Rh1和Rg3均為抗癌活性較強的成分。而對于轉化的機理，需要進一步研究。

參考文獻

[1]楊金玲，高麗麗，朱平.人參皂苷生物合成研究進展[J].藥學學報，2013，48（2）：170-178.

[2]Jong-Jin Lee， Ho-Kyun Kwon， In-Ho Jung，et al.Anti-cancer Activities of Ginseng Extract Fermented with Phellinus linteus[J].Mycobiology，2009，37（1）：21-27.

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[7]Le-Qin Cheng，Ju Ryun Na，Myun Ho Bang，et al.Conversion of major ginsenoside Rb1 to 20（S）-ginsenoside Rg3 by Microbacterium sp.GS514[J].Phytochemistry，2008，69：218-224.