食品蛋白質的琥珀酰化修飾研究進展

楊 敏，楊繼濤，楊 晰，張 媛

(甘肅農業大學理學院,甘肅蘭州 730070)

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食品蛋白質的琥珀酰化修飾研究進展

楊 敏，楊繼濤，楊 晰，張 媛

(甘肅農業大學理學院,甘肅蘭州 730070)

琥珀酰化修飾是一種常用的蛋白質結構修飾手段,其通過增加蛋白質分子凈負電荷含量而改變蛋白質結構,從而使蛋白質性質顯著改善。本文綜述了蛋白質的琥珀酰化修飾條件以及修飾后蛋白質主要功能性質的變化程度,為蛋白質改性研究提供參考依據。

蛋白質,琥珀酸酐,琥珀酰化修飾,功能性質

蛋白質的化學修飾技術主要是蛋白質的氨基酸殘基修飾技術,是通過化學試劑對蛋白質肽鏈上的特定活性基團衍生化,使部分肽鍵斷裂或引入各種功能基團,包括對氨基酸殘基的酰化、去酰胺、磷酸化、糖基化、共價交聯、水解以及氧化等。蛋白質肽鏈上的活性基團主要有氨基、羥基、巰基等。化學修飾的本質是通過新基團的引入而改變蛋白質的結構、構象以及凈電荷、疏水性等,從而改善其功能性質,如溶解性、表面性質、吸水性、凝膠性以及熱穩定性等[1]。目前,關于食品蛋白質的化學修飾研究報道主要有酰化、磷酸化、脫酰胺、糖基化、烷基化等方面[1],其中,酰化修飾因其顯著的修飾效果而備受關注。

在蛋白質的側鏈引入羧酸基即為蛋白質的酰化修飾,該修飾技術反應條件溫和,修飾程度高,部分酰化試劑可顯著改善蛋白質凈電荷,從而使其部分功能性質發生較大變化,是目前研究較多的一種化學修飾技術。酰化修飾常用試劑有乙酸酐、琥珀酸酐(丁二酸酐)、丁二酸等,其中琥珀酸酐為最常用試劑,其反應活性高,反應條件溫和,易于控制,反應程度高,改性效果顯著。由于琥珀酰化修飾后,琥珀酸以酰胺鍵與蛋白質相連,使得其凈負電荷增加顯著,從而相關性質發生顯著改變[2]。

1 琥珀酰化對蛋白質的修飾機理

蛋白質的琥珀酰化反應主要是肽鏈中的親核基團攻擊琥珀酸酐的羰基碳原子,從而誘發的一類親核取代反應。琥珀酸酐與蛋白質氨基反應原理如下:

圖1 蛋白質的琥珀酰化修飾機理Fig.1 The mechanism of succinylation on proteins

賴氨酸(Lys)ε-氨基具有較低的pK值和較弱的空間位阻,表現出較強的親核能力。脂肪族羥基(蘇氨酸,絲氨酸)和巰基(半胱氨酸)也有一定的親和能力,但不如氨基反應活性高。其他側鏈基團,如酪氨酸(Tyr)的酚羥基及組氨酸的咪唑基均可以參與琥珀酰化反應,但酰化產物不穩定[3]。由于琥珀酰基帶有負電荷,酰化修飾后蛋白質側鏈凈負電荷增加,分子間靜電斥力增大,位阻效應增強,蛋白質結構伸展,構象發生變化,因此性質顯著改變。

2 蛋白質琥珀酰化修飾的影響因素

琥珀酰化修飾程度影響著修飾后蛋白質的功能性質。目前,琥珀酰化程度常用的測定方法有茚三酮比色法和鄰苯二甲醛法[2]。琥珀酰化對蛋白質的修飾程度與琥珀酸酐用量密切相關。隨著琥珀酸酐用量的增加,蛋白質酰化程度迅速增大;當酸酐用量達到一定程度以后,酰化程度增加緩慢甚至不再變化。當琥珀酸酐用量未過量時,酰化反應主要發生在ε-氨基上,當絕大多數氨基被酰化后,羥基和巰基才會被酰化。

由于不同類型蛋白質琥珀酰化的活性基團含量不同,蛋白質分子結構和結構柔韌性不同,即使在酸酐相同用量的情況下酰化程度也會不同。幾種蛋白質的琥珀酰化程度見表1。

表1 不同蛋白質的琥珀酰化程度[4-8]Table 1 Degree of succinylation on different proteins[4-8]

也有研究指出,琥珀酸酐和蛋白質質量配比的對數值與酰化程度表現為近似線性關系,牛血清白蛋白、酪蛋白和兩種魚蛋白均表現出這樣的特性[9]。

當琥珀酸酐嚴重過量時,琥珀酰化修飾程度可高達95%以上。例如,當琥珀酸酐用量是氨基含量的100倍時,溶菌酶酰化程度可達到99%[10];β-乳球蛋白(β-lg)在琥珀酸酐用量為2.5∶1g/g蛋白質時,酰化程度為93%[11]。由此可見,琥珀酰化修飾程度較高,不同程度修飾產物可通過調節琥珀酸酐用量而獲得。

蛋白質琥珀酰化修飾過程溫度多為室溫或30～50℃,pH為8～9,反應至pH穩定即可,反應條件溫和,易于實現和控制[4,11-12]。

3 琥珀酰化修飾對蛋白質空間結構的影響

琥珀酰化修飾后,蛋白質多表現為結構伸展,吲哚基發色團暴露,三級結構改變,二級結構也會因此受到影響,不同蛋白質結構變化程度具有差異。研究指出,溶菌酶酰化99%時,結構發生變化,Stokes半徑增大,構象穩定性顯著降低,鹽酸胍對其變性程度增加;由于負電荷的增加,其自由能降低[10]。然而,也有人指出,溶菌酶琥珀酰化后二級結構變化與溫度有關,室溫下其二級結構與未酰化相似[13]。β-乳球蛋白(β-lg) 經過琥珀酰化修飾后色氨酸熒光強度下降,最大發射波長發生紅移,鹽酸胍和尿素實驗顯示其構象穩定性降低,三級結構變化;圓二色光譜(CD)實驗顯示,β-lg琥珀酰化后α-螺旋、β-折疊、β-轉角3種有序結構含量降低,無規結構增加,二級結構發生變化[11]。

琥珀酰化修飾后,酪蛋白膠束結構被破壞,膠束解離程度隨著酰化程度的增加而增加,粒徑逐漸減小[3]。酰化修飾后,酪蛋白和牛血清蛋白的二級結構變化不顯著,但三級結構變化,乳清蛋白二級結構由規則結構向無規結構轉化[14]。大豆水解蛋白酰化修飾后內源熒光值降低,最大發射波長紅移,CD測定結果顯示折疊結構減少,轉角和無規結構增加[6]。葵花籽蛋白琥珀酰化修飾后內源熒光值降低,最大發射波長紅移,三級結構改變[15]。

β-lg經過琥珀酰化修飾后通過ANS熒光實驗測得其疏水性降低[11]。酰化修飾后,酪蛋白、牛血清白蛋白、乳清蛋白表面疏水性增加[14]。也有研究指出,表面疏水性與酰化程度有關,當酰化程度為30%～40%時,琥珀酰化蠶豆蛋白表面疏水性幾乎不變;當酰化程度為50%～80%時,表面疏水性降低[16]。大豆水解蛋白在酰化程度低于86.2%時,表面疏水性降低,之后升高,這與電荷密度的增加和蛋白質構象變化有關[6]。隨著酰化程度的增加,油菜籽12S球蛋白的表面疏水性顯著降低[8]。

綜上所述,蛋白質琥珀酰化后熒光強度降低,最大發射波長紅移,三級結構發生變化,二級結構具有由有序轉變為無序的趨勢,結構變化程度與蛋白質本身的結構及酰化程度有關。

4 琥珀酰化修飾對蛋白質功能特性的影響

經過琥珀酰化修飾后,由于琥珀酰基的引入,蛋白質電荷、結構發生變化,從而引起性質改變。

4.1 琥珀酰化修飾對蛋白質溶解性的影響

琥珀酰化使蛋白質負電荷增加,修飾肽段與水的相互作用增強,蛋白質的溶解性得以改善。然而,蛋白質的溶解性與pH密切相關。琥珀酰化修飾使蛋白質等電點以上溶解性增強,等電點以下有所降低,如扁豆蛋白[4]、黎豆蛋白[17]和巴西堅果核球蛋白[5]。琥珀酰化修飾后,在pH4～11范圍內大豆水解蛋白的溶解性顯著增加[7]。燕麥蛋白經過琥珀酰化(0.2∶1g/g蛋白質)修飾后,溶解性在pH為7時增加3.79倍[10]。琥珀酰化修飾使酪蛋白在pH 5和7時溶解性增加,而在pH9時基本不變[18]。

4.2 琥珀酰化修飾對蛋白質乳化性的影響

在油-水界面,蛋白質親脂性基團在油相中定向排列,親水性基團在水相中定向排列,從而降低界面張力,表現出乳化性[19]。蛋白質經過琥珀酰化修飾后,溶解性得到改善,促進了蛋白質在油滴表面形成蛋白層,可以更好地與水相作用以發揮乳化性[20]。另一方面,琥珀酰化使蛋白質構象變化,包埋于內部的疏水性基團暴露,增強了蛋白質與油相的相互作用。然而,由于琥珀酰化修飾增加了蛋白質的負電荷,使蛋白質之間的斥力增加,阻礙了蛋白質之間的相互作用,因而不易在油水相界面形成穩定性較高的蛋白質膜,從而影響乳化穩定性[21],例如,燕麥蛋白經過琥珀酰化(0.2∶1g/g蛋白質)修飾后,乳化性提高了3.85倍,乳化穩定性僅為酰化前的45%;蠶豆蛋白琥珀酰化后乳化活性顯著提高[22]。

也有研究指出,琥珀酰化蛋白質的乳化性變化與蛋白質濃度及體系pH有關。扁豆蛋白在濃度為4%～6%時,琥珀酰化后乳化活性增加,而當濃度超出6%時乳化活性反而有所下降[4]。在pH為2時,扁豆蛋白乳化穩定性降低,在pH4～10時,由于蛋白質的溶解性顯著增強,乳化穩定性增加[4]。巴西堅果核球蛋白的乳化活性和乳化穩定性經過琥珀酰化修飾后在pH 3時有所降低,在pH>3時均得到改善[5]。黎豆蛋白經琥珀酰化修飾后乳化活性和乳化穩定性在pH 4以上均得到改善[17]。

蛋白質經過琥珀酰化修飾后乳化性變化還與酰化程度有關。例如,酰化程度較低時,大豆水解蛋白的乳化活性降低,之后隨著酰化程度的增加而增大;酰化后乳化穩定性顯著增大[7]。

4.3 琥珀酰化修飾對蛋白質發泡性的影響

蛋白質發泡性受到諸多因素的影響,如溶解性、表面疏水性、電荷等。Mirmoghtadaie(等)指出,琥珀酰化修飾雖然增加了蛋白質的溶解性,有利于發泡性的改善,但是,由于蛋白質之間靜電斥力的增加,又使發泡性得以降低,因此琥珀酰化修飾對發泡性影響不顯著[21]。扁豆蛋白琥珀酰化后泡沫穩定性降低,除了pH 2以外,其他pH條件下發泡性均增強[4]。豆薯蛋白琥珀酰化后在不同pH下發泡性和泡沫穩定性均降低[23]。由于琥珀酰化修飾后表面疏水性增強,大豆水解蛋白的發泡性顯著增加,且隨著酰化程度增大而增強,但泡沫穩定性極差[7]。

4.4 琥珀酰化修飾對蛋白質吸水性和吸油性的影響

琥珀酰化修飾使蛋白質連接了帶有負電荷的琥珀酰基,琥珀酰基與羧基間靜電斥力增加,蛋白質結構展開,使其與水的相互作用增強,吸水性增加[24-26]。蛋白質的吸油性受到蛋白質含量、表面積、疏水性、電荷、形貌等諸多因素的影響,一般歸結為物理誘捕。由于琥珀酰基占有一定空間體積,因而會使蛋白質體積增大,空隙增大,比表面積增大,因此吸油性增強[17,24,26-29]。燕麥蛋白經琥珀酰化(99%)修飾后吸水性和吸油性分別增加了3.46和1.29倍[21]。巴西堅果核球蛋白琥珀酰化修飾程度為55.8%時吸水性提高了2.04倍,吸油性提高了1.89倍;酰化程度為72%時吸水性提高了2.15倍,吸油性提高了2.04倍[5]。可見,琥珀酰化后蛋白質的吸水性和吸油性增強。

蛋白質琥珀酰化后吸水性與吸油性的變化還與酰化程度有關。隨著酰化程度的增加,蛋白質的吸水性增強[5,30]。然而,El-Adawy研究綠豆蛋白時指出,吸水性隨酰化程度呈現降低趨勢[26]。Bora研究扁豆蛋白發現,酰化程度對吸水性不產生影響[25]。堅果核球蛋白[5]、煙草蛋白[28]吸油性隨酰化程度的增大而增加,而油菜籽蛋白[27]、大豆水解蛋白[7]吸油性隨著酰化程度的增加而降低。

由此可見,由于不同蛋白質具有不同結構,琥珀酰化修飾后其吸水性和吸油性改變程度不同。

4.5 琥珀酰化修飾對蛋白質凝膠性的影響

由于琥珀酰化修飾增加了蛋白質的凈負電荷,因而對其凝膠性影響顯著。研究指出,琥珀酰化修飾使酪蛋白的凝膠性遭到破壞[31],延長了酪蛋白的凝膠時間,降低了凝膠強度[2]。

5 展望

綜上所述,琥珀酰化修飾可使蛋白質負電荷增加,結構發生變化,從而使其功能性質顯著改善,其變化程度與琥珀酰化程度有關。眾多研究一致認為,蛋白質琥珀酰化修飾后等電點以上溶解性增強,有利于蛋白質功能性質在水溶液中的充分發揮。食品蛋白質通常是食品中的主要成分,在食品加工過程中經受高溫處理、酸度變化、高壓均質等加工過程。然而,迄今為止,琥珀酰化修飾后的蛋白質在加工過程中的穩定性,如熱穩定性、高壓穩定性,及其與加工體系中的其他物質之間的相互作用尚不明確,有待進一步研究。

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Review on succinylated modification of food proteins

YANG Min，YANG Ji-tao，YAN Xi，ZHANG Yuan

(College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Succinylation is one of the modification method of protein,which increase the net charge of protein and change its structure,resulting in improvement of its functional properties. In this paper,the reaction condition,level of succinylation and change of functional properties of protein were reviewed. It would provide the references for protein modification.

protein;succinic anhydride;succinylated modification;functional properties

2014-06-10

楊敏(1981-)，女，在讀博士，講師，研究方向：乳品科學與技術。

TS201.2

A

1002-0306(2015)05-0396-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.076