海產品中副溶血弧菌檢測方法研究進展

紀懿芳,胡文忠,姜愛麗,馮 可,董 妍

(1.大連工業大學食品學院,遼寧大連 116034;2.大連民族學院生命科學學院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

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海產品中副溶血弧菌檢測方法研究進展

紀懿芳1,胡文忠2,*,姜愛麗2,馮 可3,董 妍1

(1.大連工業大學食品學院,遼寧大連 116034;2.大連民族學院生命科學學院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

副溶血弧菌是主要的食源性致病菌之一,主要存在于魚蝦貝等海產品中。人們在食用被副溶血弧菌感染的海產品時,容易出現腹瀉、嘔吐、腹痛等急性腸胃炎癥狀。本文主要介紹了副溶血弧菌的分子生物學、免疫學等幾種快速檢測方法,并對未來的發展前景做了展望。

副溶血弧菌,檢測方法

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,簡稱VP),是一種主要的食源性致病菌,嗜鹽的革蘭氏陰性細菌,屬弧菌科弧菌屬,廣泛分布于沿海、河口環境和魚、蝦、貝等海產品中。近年來,全球所有已被確診的腹瀉性腸胃炎病例中,有50%～70%的感染者是由于食用未煮熟的海產品而導致的[1]。在我國,副溶血弧菌引起的食物中毒在所有的細菌性腸胃炎中占有較高的比重,危害較大。在中國報道的食物中毒病例中,由副溶血弧菌引起的病例占了31.1%。傳統的副溶血弧菌的檢測方法耗時長,操作繁瑣,靈敏度低。因此,開發采用精確先進的生物化學方法,快速的檢測副溶血性弧菌,提高食品的安全性,確保人民生命安全,減少財產損失顯得尤為重要。

1 細菌培養法

近幾年在原有標準方法的基礎上形成了許多的新技術,以提高檢測效率特別是縮短檢測時間,包括國標分離培養結合API方法鑒定、選擇性培養基等。沈玄藝[2]等人按國標方法從食品中分離2株弧菌,用Vitek-32型細菌鑒定儀和API-20E生化試劑鑒定分析,結果符合副溶血弧菌特征,生化結果與參考標準株ATCC18072和病人分離株的副溶血弧菌一致,可定為產色素的副溶血弧菌。實驗操作簡便用時短,API實驗僅用18～24h即可完成生化鑒定。盧勉飛[3]等人開發出一種副溶血性弧菌顯色培養基(HKMVPM),顯色培養基上副溶血性弧菌菌落均呈現特異性的品紅色,而非副溶血弧菌則表現為藍綠色、無色等現象。與國外同類產品相比,分離率高低順序為 HKMVPM>KHVPM>TCBS。顯色培養基具有操作簡單、高檢出率及高特異性的特點,可進一步優化配方來增加顏色變化的敏感性和特異性使其擁有更良好的應用前景。

2 分子生物學方法

2.1 普通PCR

PCR聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR),是Mulis[4]在1985年發明的一種體外快速擴增特定基因或DNA序列的技術,具有特異性強、靈敏度高等特點。李青[5]等人對副溶血弧菌的不耐熱溶血毒素tlh基因設計特異性引物,純培養物檢測靈敏度為1.0cfu/mL,人工污染樣品檢出率為100%。黃晨陽[6]等人根據副溶血弧菌的toxR基因設計特異性引物,建立優化PCR反應體系,提高靈敏度,檢出限達到4×103cfu/mL。PCR操作簡單,耗時短,但是容易被其他雜質和DNA污染而出現假陰性或者假陽性的結果,在進行PCR檢測時,可以通過添加擴增內標、降低退火溫度、對引物進行特異性實驗等方法來排除假陰性。此外,PCR操作不可以區分活/死菌和沒有毒力的致病菌而產生假陽性的結果,可以添加疊氮溴化丙錠等DNA染料降低假陽性率。傳統PCR技術在靈敏度、特異性、儀器自動化程度和實驗成本都有一定的局限性,所以在傳統PCR基礎上發展起來了許多PCR改進技術,如多重PCR、熒光定量PCR、巢式PCR等,從不同方面彌補傳統PCR的不足。

2.2 多重PCR

2.3 實時熒光定量PCR法(RT-PCR)

實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence qualitative PCR),在基礎的PCR反應體系中加入熒光基團,通過檢測熒光量來測定樣本的核酸量。熒光PCR具有高靈敏性和特異性,實驗在封閉體系中完成,減少了污染的可能性,并可做到定性和定量分析等特點[10-11]。Garrido[12]等人分別從海水和海產品中分離得到副溶血弧菌進行實驗,用多重熒光定量PCR同時檢測副溶血弧菌的tdh和trh基因,tdh、trh1和trh2的檢出限分別為26、11和8cfu/25g,此方法與國際標準方法相比時間可以縮短1/3。Blackstone[13]針對副溶血弧菌的tdh基因進行了實時熒光定量PCR,同時檢測13株非副溶血弧菌細菌,只有副溶血弧菌的tdh基因顯熒光。同時用AWM堿性蛋白胨水富集牡蠣中的副溶血弧菌結合實時PCR,24h內可以檢測61份樣品,比普通的平板劃線富集法檢測多4倍。林強[14]等人以副溶血弧菌的毒素調控基因toxR,設計特異性引物及TaqMan探針。用熒光定量PCR方法對含toxR基因質粒、純培養物和人工污染的牡蠣樣品進行靈敏度實驗,靈敏度分別為15拷貝、18cfu/mL和180cfu/mL,多次重復變異系數在1%左右。熒光定量PCR探針成本高、設計難,在實驗中我們要確保引物的特異性和條件的最優化。TaqMan和分子信標熒光探針是熒光定量PCR的檢測主流,隨著探針技術的發展,出現更穩定更特異的探針,如可以快速產生信號的Scorpion探針和設計簡單、成本低、特異性可靈活改變的雙鏈探針,此外還有cycling探針、Simple探針和神標熒光探針。同時,數據軟件的更新改進,與其它技術連用和更靈敏的熒光標記材料的不斷出,將是此技術未來發展的主流趨勢。

2.4 環介導等溫擴增技術(LAMP)

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是Notomi[15]等在2000年開發的一種新型核酸恒溫擴增方法,Lamp技術是在恒定的溫度下,針對靶基因上的6個區域設計4條引物,在DNA聚合酶作用下進行擴增反應。Lamp在恒定溫度下,不到1h就能達到109～1010倍的擴增,具有特異性強,靈敏度高,操作簡單等特點,被廣泛應用于細菌、病毒病原體、真菌病原體檢測等方面[16-17]。金雪花[18]等人針對副溶血性弧菌tlh基因用EMA-LAMP法檢測、鑒別副溶血弧菌死/活細菌。實驗得出抑制細菌死細胞LAMP擴增的EMA最小濃度為8.0μg/mL。EMA-LAMP方法檢測副溶血的檢出限為1.0×102cfu/mL。實驗可以有效的檢測出副溶血弧菌的死/活細胞。但實驗中EMA達到一定濃度時也會對活細胞產生毒副作用,因此實驗中要注意EMA的用量,同時還要控制溫度和曝光時間。Yamazaki[19]等人檢驗171份海產品樣品副溶血弧菌污染情況,利用堿性蛋白胨富集海產品中的副溶血弧菌,針對副溶血弧菌的tlh基因設計特異性引物。結果表明lamp方法靈敏度和特異性分別達到100%和90.8%,比傳統方法檢出率更高,適用性更強。Prompamorn[20]等人應用LAMP-LFD方法快速檢測副溶血弧菌,用LAMP方法結合FITE核酸檢測側向層析試紙,對副溶血的tlh基因設計引物。純培養物靈敏度為120 cfu/mL,比常規PCR檢出限少一個數量級。LAMP技術不需要特殊的儀器,適用于現場操作,但實驗在常溫下進行,操作時容易被污染,同時食品中的鈣離子和血液等也會影響鑒定結果,可通過精細處理樣品、操作時避免氣溶膠產生、分裝試劑、加熱、添加Sybr greenI染色劑等方法提高準確性減少假陰性。LAMP結果可以通過肉眼觀察沉淀,但是并不是特別明顯,現多在反應前后添加指示劑來判斷反應結果,已有Sybr greenI、鈣黃綠素、羥基萘酚藍和羅丹明 B 衍生物等指示劑。

2.5 原位熒光恒溫核酸擴增方法(In Situ LAMP)

原位熒光恒溫核酸擴增方法(fluorescence in situ loop-mediated isothermal amplification),結合了原位雜交和LAMP技術,可以檢測單拷貝基因,省略提取DNA等步驟,反應溫度低,結果較易觀察[21]。Fumito[22]等人首先將該技術用于大腸桿菌O157∶H7的定性和定量檢測中。Wang[23]等人應用原位熒光恒溫擴增法檢測活的非可培養狀態的副溶血弧菌,以thl為目的基因設計引物,對副溶血弧菌、溶藻弧菌和人工污染樣品進行原位熒光擴增,使用PCR、LAMP和in suit LAMP方法對市售水產品進行檢測。in suit LAMP實驗特異性強,可有效檢測出副溶血弧菌。最低檢出限低于其他檢測方法,可以達到檢測出單個細菌。實驗不受其他雜質的影響,人工污染樣品檢出率可以達到96%以上。但是,in suit LAMP在用于不同細菌時候,由于細菌結構復雜,在處理細胞壁通透性時需要用特異的方法進行處理,否則不利于核酸擴增反應進行和避免擴增后的產物流出。

2.6 基因芯片

基因芯片,又稱DNA微陣列(DNA microarray),最早是由Southern[24]在1989年提出的。基因芯片是把大量已知序列基因探針有序的、高密度的集成在同一玻片上,經過標記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點上的探針雜交,通過檢測雜交信號,對生物細胞或組織中大量的基因信息進行分析[25]。韓海紅[26]等人研制副溶血弧菌全基因組芯片,挑選出4770條基因,對各基因經行PCR擴增,點樣法制備芯片,經PCR法確定準確性,成功的研制了一批質量良好的副溶血弧菌全基因組DNA芯片。王軍[27]等人根據臨床疾病表現的特點進行組合,設計特異性引物及探針,制備DNA芯片,運用多重PCR和基因芯片技術一次檢測腹瀉病糞便同一標本中7種常見致病菌。64份樣本中檢測出45份致病菌,其中12份為副溶血弧菌,副溶血弧菌檢出限最低達到10cfu/mL。基因芯片從20世紀90年代發展至今,尤其高通量、檢測速度快、準確性高、特異性強、有多色熒光標記、自動化程度高等特點在生物研究領域發揮重大作用。但是該技術也存在一些問題,制作成本高,芯片的制作和檢測都需要價格高傲的設備和復雜的制作過程,對致病微生物基因序列信息的匱乏,芯片的質量等。未來基因芯片將沿著提高探針陣列的集成度和穩定性,降低成本,與其它技術結合使用,和生物信息學聯合發展等方向,將此技術擴展到生命科學研究的各個領域,成為在商業化快速檢測重要手段。

3 免疫學檢測方法

3.1 酶聯免疫吸附(ELISA)法

ELISA具有特異性強、儀器設備簡單、低成本、試劑可長時間保存、無放射性同位素污染等特點。多被用于病原微生物、轉基因食品、農獸藥殘留檢測[28]。李國[29]等人從文蛤中分離出副溶血弧菌制備血清,用辣根過氧化物酶標羊抗兔血清為酶標二抗,對副溶血進行間接ELISA檢測,檢測結果靈敏度較低。何彬斌[30]分離純化抗副溶血弧菌雞卵黃免疫球蛋白建立的間接ELISA方法,一抗的最佳工作質量濃度為15lg/mL,二抗的最佳稀釋度為1/10000,副溶血弧菌純培養液的檢出限為1.0×105cfu/mL,實驗結果有較強的特異性,能夠確切地對副溶血弧菌進行檢測。ELISA 不可避免地存在著一些缺陷,如對試劑的選擇性高、對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應,分析低分子量或不穩定的化合物有一定的困難等,但與其它檢手段聯合使用,如色譜、氣相色譜質譜聯用、電化學方法等,既可增加檢測的靈敏度又可降低交叉反應,更準確地定量。

3.2 免疫膠體金技術(ICG)

免疫膠體金技術(Immune colloidal gold tech-nique),是以膠體金為標記物,利用特異性抗原抗體反應,在光鏡電鏡下對抗原或抗體物質進行定位、定性乃至定量研究的標記技術。膠體金制備簡單、價低、可用于常規光鏡和熒光顯微鏡、結果直觀、可較長時間保存、對儀器要求低等特點[31]。楊靖亞[32]利用雙抗體夾心法開發斑點免疫膠體金滲濾測試盒,能準確的檢測副溶血弧菌tdh基因,其最低檢測限達到250μg/mL。檢測結果可在4℃條件下保存12周,其準確性和穩定性均未發生較大的改變。王報貴[33]等人對膠體金免疫試紙條進行改進,改進后的試紙條具有較好的特異性及靈敏度,在15min內就可以完成檢測。但是,免疫膠體金實驗容易被溫度和雜質影響,假陰性率較高。可以采用信號放大系統如生物素-親和素系統,在同一膜上作多種項目測定和多項目的組合測定,應用TROPT檢測光密度等方法來提高免疫膠體金檢測的敏感性、特異性、實現多元檢測。

4 利用噬菌體及其在副溶血弧菌快速檢測中的初步應用

Peng[34]等人利用噬菌體的高度專一性特點,從副溶血弧菌分離得到噬菌體,找出理想的噬菌體(副溶血弧菌p1)。用副溶血弧菌p1結合細菌熒光素酶-FMN和NADH氧化還原酶經行體外發光體系對副溶血弧菌的定量檢測。檢測副溶血弧菌回收率可以達到95%以上,重復實驗偏差小于1,整個檢測過程在4.5h之內可以完成。該方法準確度、復性、精密度和時短都達到較高的要求,適用于現代快速檢測。但是,由于VP菌噬菌體裂解譜均比較窄,應用范圍有限,可通過分子生物學方法改造噬菌體的基因組,或者通過將不同裂解譜的噬菌體混合使用,以擴大裂解譜的范圍使其更適用于現代化檢測。

5 變性高效液相色譜檢測技術

變性高效液相色譜檢測技術(denaturing high performance liquid chromatography),是由聚合酶鏈式反應結合變性高效液相色譜的技術。廖亮[35]等人利用DHPLC在非變性溫度下進行雙鏈DNA分離的原理及DHPLC技術分析副溶血弧菌特異性PCR擴增產物,檢測結果可觀。DHPLC可以多次測量多個樣品并可避免單獨PCR反應后期易污染等特點。

6 前景和展望

副溶血弧菌的傳統國標檢測方法要經過基礎的分離、增菌、鏡檢和生化鑒定等繁瑣步驟,現代進出口食品中副溶血弧菌標準檢測方法常有實時熒光PCR、LAMP和MPCR-DHPLC法等,并結合傳統方法進行鑒定。此外目前還有吖啶、橙染色法、高通量微生物鑒定儀、蛋白芯片法和電化學免疫傳感器等在實驗室使用的檢測技術。現代分子生物技術因快速、準確、操作簡便等特點已經逐步進入市場并占有主流地位。但是,每種方法都有自己的優勢和劣勢,各項技術的優化和搭配使用是我們要在現有的基礎上努力的方向。如LAMP技術與生物傳感器技術相結合,酶聯免疫磁珠技術與PCR技術相結合。基因芯片技術融合了PCR、納米芯片和探針雜交。可以同時檢測多種致病菌,達到高效、準確等特點,適用于現代檢測快速和高通量的要求,具有廣泛的應用空間。

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Advancement of detection techniques forVibrioparahaemolytiousin aquatic products

JI Yi-fang1,HU Wen-zhong2,*,Jiang Ai-li2,FENG Ke3,DONG Yan1

(1.College of Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

Vibrioparahae-molytiousis one of the most frequent causes of death as food-borne pathogens in food. It infects the seafood products mostly and when people eat the seafood which is contaminated byVibrioParahaemolytcus,it will cause acute gastroenteritis,such as diarrhea,vomiting,abdominal eramps and so on. Molecular biological and immunological methods of the detection forVibrioParahaemolytcusand prospect the development direction of this field were summarized.

V.parahaemolyticus;detection

2014-05-13

紀懿芳(1989-),女,在讀碩士,研究方向:食品科學。

*通訊作者:胡文忠(1959-),男,博士，教授,研究方向:食品科學。

國家自然科學基金項目(31172009);國家科技支撐計劃項目(2012BAD38B05);大連市金州新區科技計劃項目(2012-A1-049)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)05-0365-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.069