三種貯藏低溫對厚皮甜瓜果實活性氧產生和清除的比較

李海杰,葛永紅,董柏余,龔 迪,劉文妮,畢 陽

(甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

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三種貯藏低溫對厚皮甜瓜果實活性氧產生和清除的比較

李海杰,葛永紅,董柏余,龔 迪,劉文妮,畢 陽*

(甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

厚皮甜瓜,活性氧,低溫,冷害

厚皮甜瓜(CucumismeloL.)是我國西北地區的特色經濟作物,其果香味甜,風味獨特,深受廣大消費者的喜愛。然而,由于大多數厚皮甜瓜果實產期相對集中,且正值高溫夏季,加之缺乏有效的包裝和必要的冷鏈,采后壽命不長且爛損嚴重[1]。雖然低溫能夠有效延長甜瓜的采后壽命,但甜瓜果實對冷害敏感[2]。據報道,‘白蘭瓜’的適宜冷藏溫度為9～10℃,4～5℃則會引起不同程度的冷害[3]。早熟、中熟和晚熟哈密瓜分別在7、5和3℃下均會不同程度發生冷害[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試果實厚皮甜瓜品種為‘金紅寶’,于2013年7月10日至30日采自甘肅省民勤縣收成鄉露天栽培大田,單果套發泡網袋后入包裝箱(12個/每箱),第2d運抵實驗室。

實驗儀器有恒溫培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;紫外分光光度計 日本島津UV-2450;YXJ-2離心機 湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 挑選大小均一、無機械傷和病害的健康果實,分別貯藏在3、7和9℃的恒溫培養箱中貯藏待用。每個處理12個果實,重復3次。

1.2.2 取樣 分別于第0、4、8、12d時從恒溫培養箱中取出果實,在室溫下放置24h后取樣。用水果刀取果實赤道附近皮下5～10mm處果肉組織,用錫箔紙包好,每包3g,液氮速凍后,在-80℃超低溫冰箱中保存待測。

H2O2含量參照李永才等方法[11]。取3g冷凍的組織樣品,加入5mL冷丙酮,冰浴磨成勻漿后于4℃下12000×g離心20min。取1mL上清液,加入100μL 20%的四氯化鈦溶液(溶于濃鹽酸,V/V)和200μL濃氨水,混勻反應5min后離心15min。沉淀部分用冷丙酮洗滌4次以減少色素的干擾,最后將沉淀溶于3mL 2mol/L H2SO4溶液中,于410nm測定溶液的吸光度值。按同法作H2O2標準曲線。H2O2含量以μmol/g表示。重復測定3次。

1.2.4 抗氧化酶活性的測定

1.2.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性測定 參照王云飛等方法[12]:取3g冷凍的組織樣品,加入3mL 100mmol/L磷酸緩沖液(pH7.5,含5mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)和2% PVPP(W/V)),冰浴條件下研磨成勻漿后于4℃、12000×g離心30min,上清液立即用于酶活性測定。

SOD活性測定:取5mL離心管4支,2支為測定管,另2支為對照管,依次加入1.5mL 50mmol/L磷酸緩沖液、0.3mL 130mmol/L甲硫氨酸(MET)溶液、0.3mL 750μmol/L氮藍四唑(NBT)溶液、0.3mL 100μmol/L EDTA-Na2溶液、0.3mL粗酶液,最后加入0.3mL 20μmol/L核黃素。其中對照2支管以緩沖液代替酶液,混勻后將1支對照管置于暗處,其它各管于4000LUX日光燈下反應15min。至反應結束后,以不照光管做空白參比,于560nm處分別測定其它各管的吸光度值。SOD活性以每毫克蛋白抑制氮藍四唑(NBT)光化還原的50%為一個酶活性單位(U)表示。重復測定3次。

SOD比活力(U)=(A0照光對照管-As樣品管)/(0.5×A0照光對照管×P測定用酶液蛋白含量)

CAT活性測定:反應體系包括2mL 10mmol/L H2O2(用50mmol/L、pH7.5的磷酸緩沖液配制)和200μL粗酶液。在240nm處測定2min內樣品的吸光值。CAT活性以0.01 ΔOD240/min·g表示。重復測定3次。

1.2.4.2 谷胱甘肽還原酶(GR)活性測定 參考Ren等方法[13]。稱取3g冷凍的組織樣品,加入5mL經4℃預冷的100mmol/L、pH 7.5的磷酸緩沖液(含1mmol/L EDTA),在冰浴條件下研磨成勻漿,于4℃、12000×g離心30min,上清液用于GR活性測定。酶促反應體系由3mL 100mmol/L pH7.5的磷酸緩沖液(含1mmol/L EDTA),0.1mL 5mmol/L GSSG(氧化型谷胱甘肽),0.2mL酶液和30μL 3mmol/L NADPH組成(最后加入NADPH啟動酶促反應)。從啟動后15s開始記錄反應體系在340nm的吸光度值,連續測定2min。酶活性表示為0.01ΔOD340/(min·g)。樣品重復測定3次。

1.2.4.3 抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定 參照Ren等方法[13]。稱取3g冷凍的組織樣品,加入5mL經4℃預冷的100mmol/L磷酸緩沖液(pH7.5,含1mmol/L EDTA),在冰浴條件下研磨成勻漿,于4℃、12000×g離心30min,收集上清液,用于APX活性的測定。酶促反應體系由2mL 100mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.5,含1mmol/L EDTA),0.8mL 3mmol/L抗壞血酸,200μL粗酶液和0.5mL 0.5mmol/L H2O2組成,最后加入H2O2啟動酶促反應。從啟動后15s開始記錄反應體系在290nm的吸光度值,連續測定2min。酶活性表示為0.01ΔOD290/(min·g)。樣品重復測定3次。

1.3 數據處理

用Excel 2007軟件進行數據處理,計算標準偏差并制圖,用SPSS19.0統計分析軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

圖1 三種貯藏低溫處理對果實·產生速率 和H202含量的影響。Fig.1 Effect of three low temperatures on the production rate of ·(A)and H2O2 content(B)of fruits注:圖中垂線代表標準誤差(±SE)。

2.2 三種貯藏低溫處理對果實SOD、CAT、GR和APX活性的影響

圖2 三種貯藏低溫處理對果實SOD、 CAT、GR和APX活性的影響。Fig.2 Effect of three low temperatures on the activities of SOD(A),CAT(B),GR(C)and APX(D)of fruits注:圖中垂線代表標準誤差(±SE),將7℃和9℃下果實的 活性分別與3℃進行比較,*表示差異顯著 (0.01

果實在3℃貯藏期間GR活性是逐漸升高的,并在第12d達到最大值,分別高于7℃和9℃的35.58%和25.99%。在7℃貯藏的第4d GR活性出現了最高值,并且高于3℃的24.37%,9℃的23.65%,之后GR活性隨著貯藏時間的延長而逐漸降低。在9℃貯藏期間GR的活性變化不大(圖2C)。3℃貯藏期間APX活性逐漸增加,在第12d時活性達到最大,比7℃和9℃分別升高了25.73%和34.51%。在7℃和9℃貯藏過程中都是在第4d出現最大值,并隨著貯藏時間的增加逐漸降低。但是7℃貯藏的果實APX活性在第4d,第8d和第12d分別高于9℃的8.26%,13.50%和6.99%(圖2D)。本實驗觀察到的7℃下果實的APX和GR活性也呈現先增高后降低的趨勢,表明抗壞血酸-谷胱甘肽循環參與了果實的活性氧清除過程,顯著提高了果實的耐冷性。然而,在3℃下貯藏前期果實APX和GR活性受到抑制,表明冷害抑制了谷胱甘肽循環,至于該循環如何在果實冷害中發揮作用仍需探求。

3 討論

4 結論

本實驗研究表明,3℃下大量的H2O2積累以及較低的抗氧化酶活性是導致甜瓜果實冷害發生的重要原因,7℃下果實維持了良好的活性氧產生和清除平衡,為厚皮甜瓜果實貯藏的適宜溫度。但關于這三種溫度下果實細胞膜完整率、MDA含量和LOX酶活性的變化及其與冷害之間關系仍有待于進一步研究。

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A comparison of reactive oxygen species production and scavenging inmuskmelon fruits during storage under three low temperatures

LI Hai-jie,GE Yong-hong,DONG Bo-yu,GONG Di,LIU Wen-ni,BI Yang*

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

muskmelons;reactive oxygen species;low temperature;chilling injury

2014-05-04

李海杰(1987-)，女，碩士研究生，研究方向：果蔬采后生物學與技術。

*通訊作者:畢陽(1962-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬采后生物學與技術。

農業部行業專項(201303075)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)05-0325-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.060