采后BTH處理對蘋果果實苯丙烷代謝和病程相關蛋白積累的增強作用

葛永紅,李燦嬰,朱丹實,董柏余,蘭 琳

(1.渤海大學化學化工與食品安全學院,遼寧錦州 121013;2.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

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采后BTH處理對蘋果果實苯丙烷代謝和病程相關蛋白積累的增強作用

葛永紅1,李燦嬰1,朱丹實1,董柏余2,蘭 琳2

(1.渤海大學化學化工與食品安全學院,遼寧錦州 121013;2.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

本文探討采后苯丙噻重氮(BTH)處理對蘋果果實苯丙烷代謝和病程相關蛋白產生的增強作用。以“國光”蘋果為試材,采后用100mg/L BTH浸泡處理10min,測定處理對果實苯丙烷代謝相關酶活性、產物積累和病程相關蛋白產生的影響。結果表明,BTH處理顯著提高了蘋果果實體內苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆素輔酶A連接酶(4CL)的活性,增加了總酚、類黃酮及木質素含量,同時提高了β-1,3葡聚糖酶(GLU)、幾丁質酶(CHT)和過氧化物酶(POD)的活性。由此表明,采后BTH處理可通過誘導果實苯丙烷代謝和促進病程相關蛋白的產生來增強果實對采后病害的抗性。

果實,BTH,苯丙烷代謝,病程相關蛋白,誘導抗性

蘋果(MalusdomesticaBorkh)屬于薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)植物,是典型的呼吸躍變型果實,在采后貯藏、運輸和銷售過程中很容易腐爛變質,給生產者和經營者帶來巨大的經濟損失。由病原物引起的采后病害是導致果蔬爛損的重要原因,每年的損失在發展中國家可占其果蔬總產量的30%～50%,在發達國家可占10%～30%[1]。由Penicilliumexpansum引起的青霉病是蘋果采后的主要病害之一[2],傳統的控制方式是采用化學殺菌劑如噻菌靈、甲基硫菌靈、嘧霉胺和撲海因等[3-4],但存在殺菌劑殘留、環境污染和病原物產生抗藥性等問題[5]。誘導果蔬的抗病性已成為近年來控制或減輕采后病害的新手段[3-5]。苯丙噻重氮(benzothiadiazole,BTH)屬水楊酸類似物,是第一個人工合成的化學誘抗劑。在有效濃度范圍內,BTH不表現直接的殺菌活性,但能誘導植物產生抗病性,并且不會對環境造成污染[6]。已有研究報道BTH處理能夠誘導多種果實的抗病性如草莓、桃、梨、蘋果、厚皮甜瓜、芒果、馬鈴薯等[7-14]。BTH誘導果實產生抗病性的機理主要涉及活性氧的產生、活化苯丙烷代謝途徑、積累病程相關蛋白等[15]。我們的前期研究發現采后BTH處理能夠顯著降低蘋果果實的青霉病,并且誘導了果實體內活性氧的產生及活性氧代謝相關酶活性的提高,但關于其他的機理沒有進行系統的研究。

本實驗以蘋果為試材,在前期研究的基礎上,重點探討采后BTH處理對果實苯丙烷代謝相關酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆素輔酶A連接酶(4CL)及主要產物總酚、類黃酮、木質素等的積累和β-1,3葡聚糖酶(GLU)、幾丁質酶(CHT)和過氧化物酶(POD)等病程相關蛋白產生的影響,為闡明BTH誘導蘋果抗病性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

國光蘋果于2013年9月采自甘肅省國營條山農場,單果包裝入紙箱后當天運抵甘肅農業大學采后生物學實驗室,常溫((22±2)℃,RH 50%～60%)下貯藏待用;BTH由Novatis公司提供(有效濃度50%)。

UV-2450型分光光度計 日本島津;H-1850R型離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;WYX-A微型旋渦混合器 上海躍進醫療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 BTH處理 大小均勻,無機械損傷和病蟲害的果實分別用100mg/L BTH溶液和清水浸泡(對照)10min(內含0.05% Tween 20),取出晾干后入包裝箱,于常溫條件下((22±2)℃,RH 55%～60%)貯藏待用,每處理用果實30個,重復3次。

1.2.2 取樣 參照范存斐等方法[16]。BTH和清水處理后的果實分別于0、2、4、6、8d取皮下1～5mm 處果肉組織3g,鋁箔紙包裹,用液氮速凍后在-80℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2.3 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定 參照Liu等方法[8]。酶反應體系包括:2mL 0.2mol/L硼酸緩沖液(pH8.8),300μL酶粗提液和1mL L-苯丙氨酸(0.02mol/L)。24℃下反應2min 后測其OD290。空白以緩沖液代替酶粗提液。以U/g FW(鮮重)表示酶活性,每分鐘內OD290變化0.01為1個活性單位(U)。

1.2.4 4-香豆素-輔酶A連接酶(4 CL)活性測定 參照范存斐等方法[16]。以每分鐘吸光值變化0.01為1個活性單位(U),4 CL活性以U/g FW表示。

1.2.5 總酚和類黃酮含量的測定 參照范存斐等方法[16]。總酚含量以OD280/g FW表示,類黃酮含量表示為OD325/g FW。

1.2.6 木質素含量的測定 參照范存斐等方法[16]。木質素含量以OD280/g FW表示。

1.2.7 過氧化物酶(POD)活性的測定 參照葛永紅等方法[17]并修改。酶反應體系包括1.8mL愈創木酚(0.05mol/L),30μL酶粗提液和100μL,2% H2O2,然后于470nm波長下測定吸光度的變化,以每分鐘內OD470變化0. 01為1個活性單位(U),POD活性以U/g FW表示。

1.2.8 β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活性的測定 參照Ge等方法[18]并修改。酶反應體系包括0.8mL,1mg/mL昆布多糖,0.2mL酶液,2mL銅試劑,2mL砷鉬酸試劑,反應后在660nm處測定吸光度,對照標準曲線求出樣品液中的葡萄糖量。在最適反應條件下(37℃)下每秒鐘每升酶液催化底物昆布多糖產生1μmol的葡萄糖為一個酶活力單位(U)。

1.2.9 幾丁質酶(CHT)活性的測定 參照葛永紅等方法[17]。以每分鐘生成1μmol N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

1. 3 數據處理

全部實驗數據用Microsoft Excel 2003 處理并作圖,用SPSS16.0統計軟件進行LSD統計分析,圖中以標準誤差(±SE)表示。

2 結果與分析

2.1 BTH處理對蘋果果實PAL、4CL活性的影響

PAL 是苯丙烷代謝途徑的一個限速酶,其活性高低與酚類、黃酮類和木質素的積累密切相關。隨著貯藏時間的延長,蘋果果實PAL先升高后降低,但BTH處理顯著提高了果實PAL活性,在貯藏第4d達到最大,高出對照71.4%,第8d BTH處理果實PAL活性又略有升高,而對照則呈下降趨勢(圖1A)。4CL活性的變化趨勢基本和PAL一致,BTH處理也顯著提高了蘋果果實4CL活性,在貯藏第6d活性達到最大,高出對照32.2%(圖1B)。

圖1 采后BTH處理對蘋果果實PAL(A) 和4CL(B)活性的影響Fig.1 Effect of postharvest BTH dipping treatment on PAL(A)and 4CL(B)activities in apple fruit

2.2 BTH處理對蘋果果實總酚和類黃酮含量的影響

總酚和類黃酮是苯丙烷代謝的產物,其含量高低與果實預防病原菌的侵入有關。處理和對照蘋果果實總酚含量在貯藏期間總體呈先升高后下降趨勢,但BTH處理顯著提高了果實總酚含量,并且在貯藏第4d出現高峰,高出對照25.9%(圖2A)。貯藏期間果實類黃酮含量先升高后降低,BTH處理果實類黃酮含量顯著高于對照果實,如在貯藏第4d時類黃酮含量高出對照27.2%(圖2B)。

圖2 采后BTH處理對蘋果果實總酚(A) 和類黃酮(B)含量的影響Fig.2 Effect of postharvest BTH dipping treatment on the content of total phenolic compounds(A) and flavonoids(B)in apple fruit

2.3 BTH處理對蘋果果實木質素含量的影響

木質素是苯丙烷代謝途徑的產物,果實中木質素的積累有利于增強細胞壁厚度,從而提高對病原物的抵抗力。蘋果果實在貯藏期間,木質素含量總體呈先升高后下降趨勢,對照果實中木質素含量一直維持在一個較低的水平,但BTH處理果實中木質素含量顯著高于對照,并且在貯藏第6d達到最大,高出對照35.4%(圖3)。

圖3 采后BTH處理對蘋果果實木質素含量的影響Fig.3 Effect of postharvest BTH dipping treatment on lignin content in apple fruit

2.4 BTH處理對蘋果果實POD活性的影響

POD廣泛存在于植物中,在果實體內主要參與活性氧的清除、木質素的合成等過程。在整個貯藏期間對照和BTH處理果實POD活性都呈先上升后下降的趨勢,但是BTH處理果實POD活性顯著高于對照,如在貯藏第4、6d分別高出對照49.8%和55.8%(圖4)。

圖4 采后BTH處理后蘋果果實POD活性的變化Fig.4 Changes in the activity of POD in apple fruit after BTH dipping treatment

2.5 BTH處理對蘋果果實GLU和CHT活性的影響

GLU和CHT是兩種主要的病程相關蛋白,主要用來降解病原物細胞壁,從而導致病原物死亡。貯藏期間對照果實GLU活性總體維持在一定水平,而BTH處理顯著提高果實中GLU活性,在貯藏第6d出現活性高峰,高出對照63.7%(圖5A)。CHT活性總體呈先升高后降低趨勢,但BTH處理果實中CHT活性顯著高于對照果實,在貯藏第6d達到最大,高出對照30.3%(圖5B)。

圖5 采后BTH處理后蘋果果實GLU(A) 和CHT(B)活性的變化Fig.5 Changes in the activity of GLU(A)and CHT(B) in apple fruit after BTH dipping treatment

3 討論

苯丙烷代謝是植物和果蔬中次生代謝產物合成的主要途徑,在抗病中具有重要的作用[19]。PAL和4CL是該途徑中的關鍵酶[25],PAL能夠調控植物和果實中酚類、黃酮類、生物堿、花青素、木質素等抗菌物質的合成,木質素的合成有利于強化細胞壁,增強對病原物侵染的抵抗力[20],而4CL主要調控苯丙烷代謝主途徑向分支途徑的轉折[21]。本實驗表明,BTH能顯著誘導蘋果果實中PAL和4CL活性的升高,同時促進了果實中總酚、類黃酮和木質素的積累。桃[8]、梨[9],厚皮甜瓜[22]、草莓[23]等果實的研究中也得到了類似的結果。本實驗還發現BTH處理蘋果果實貯藏后期PAL活性有所升高,這與我們在甜瓜果實上的研究結果類似[22],可能是因為前期PAL和4CL活性的升高促進了黃酮類、生物堿和花青素的積累,而木質素的合成過程比較復雜,需要在POD、過氧化氫及漆酶的共同作用下合成,因此后期PAL的升高主要是調控木質素的合成。還有研究發現采前BTH處理也能誘導甜瓜果實中苯丙烷代謝產物的積累,從而降低潛伏侵染的發生率[28]。酚類物質在多酚氧化酶(PPO)的作用下氧化成對病原菌產生高毒性的醌類物質,直接抑制侵染寄主的病原物生長[24]。此外,酚類物質還可以作為木質素合成的前體物質,促進細胞壁中木質素的積累,從而增厚細胞壁提高對病原物抵抗力[25-26]。類黃酮具有直接的抑菌活性,可抑制真菌孢子萌發、芽管伸長和菌絲生長[27]。由此表明,采后BTH處理可明顯激活蘋果果實體內酚類和類黃酮合成途徑,以增加果實對病原物侵染的抵抗能力。

病程相關蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)是植物受到病原菌侵染或非生物脅迫條件下產生的小分子蛋白質,在抗病過程中發揮著重要作用[21]。目前已經發現的PRs有17種,根據其結構和功能的不同表示為PR-1至PR-17,其中PR-2和PR-3,8,11分別具有GLU和CHT活性,可以直接分解真菌細胞壁主要成分為葡聚糖和幾丁質,破壞其結構[21]。本研究結果發現,BTH處理可顯著提高GLU和CHT活性。已有研究報道,采前或采后BTH處理能夠誘導甜瓜[28]、桃[8,29]、芒果[30]、梨[31]果實中GLU和CHT的活性,從而提高果實的抗病性。PR9具有POD活性,參與果實體內木質素的合成、細胞壁結構蛋白的交聯以及活性氧的清除等[15,21]。本研究結果表明,BTH處理誘導了POD活性的提高,促進了木質素含量的積累,提高了果實的抗病性。這與在甜瓜[17]、砂糖橘[32]、芒果[33]上的研究結果相一致。此外,BTH處理還能誘導芒果和番木瓜果實的過氧化物酶基因(POD)表達[34-35]。有關BTH處理后蘋果果實中苯丙烷代謝和病程相關蛋白基因表達有待進一步分析研究。

4 結論

采后100mg/L BTH處理顯著提高了蘋果果實PAL和4CL活性,并且促進了苯丙烷代謝產物總酚、類黃酮和木質素含量的提高。BTH處理還促進了蘋果果實POD,GLU和CHT活性的提高。由此表明,采后BTH處理可通過激活蘋果果實苯丙烷代謝途徑增強組織結構,促進病程相關蛋白的產生,從而提高了果實抵抗病原物侵染的能力。

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Activation of postharvest BTH treatment on phenylpropanoid pathwayand pathogenesis-related proteins accumulation in apple fruit

GE Yong-hong1,LI Can-ying1,ZHU Dan-shi1,DONG Bo-yu2,LAN Lin2

(1.College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Jinzhou 121013,China;2.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

The effect of benzothiadiazole(BTH)dipping on phenylpropanoid pathway and accumulation of pathogenesis-related proteins in apple fruit was investigated in this paper. Apple fruit(cv. Guoguang)were dipped in 100mg/L BTH for 10min to study the effect of BTH on key enzymes activities,metabolites accumulation in phenylpropanoid pathway and production of pathogenesis-related proteins(PRs). The results indicated that BTH treatment significantly increased the activities of phenylalanine ammonia-lyase(PAL)and 4-coumaric acid-coenzyme A ligase(4CL),and the content of total phenolic compounds,flavonoids and lignin. The activities of β-1,3-glucanase(GLU),chitinase(CHT)and peroxidase(POD)were also induced by BTH treatment. These results suggest that postharvest BTH treatment induced disease resistance in apple fruit by activating phenylpropanoid pathway and promoted the accumulation of PRs.

fruit;benzothiadiazole(BTH);phenylpropanoid pathway;pathogenesis-related proteins;induced resistance

2014-06-03

葛永紅(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：果蔬貯藏與保鮮。

國家自然科學基金(31160405)；渤海大學博士啟動基金(bsqd201405)；遼寧省食品安全重點實驗室項目(LNSAKF2013021)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)05-0306-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.056